Гк банное: Горнолыжный центр ГЛЦ «Банное» офицальный сайт Башкирия

Уменьшение нейритных бляшек в коре головного мозга мышей Tg-R3PA. A – D , Иммуноконфокальный анализ отложения конденсированного Aβ в гиппокампе мышей Tg-PA и Tg-R3PA в возрасте 6 месяцев с использованием антитела 6E10 против Aβ (красный) и антитела R458 против C-конца RTN3 (зеленый). По сравнению с мышами Tg-PA, мыши Tg-R3PA имели значительно меньшее количество нейритных бляшек Aβ в коре головного мозга ( A , B ), но это снижение было менее значительным в их гиппокампе ( C , D ).Примечательно, что у мышей Tg-R3PA образовывались RIDN в основном в области CA1 с небольшим распространением в области CA3 и зубчатой ​​извилины, тогда как у мышей Tg-PA не продуцировались подобные типы диспергированных RIDN. Хотя в кортикальной области мышей Tg-R3PA или Tg-PA не было обнаружено диспергированных RIDN, амилоидные бляшки в образцах Tg-R3PA были явно окружены большим количеством RIDN, как указано стрелками. E . Аналогично помеченные очаги нейритных бляшек были количественно проанализированы на основании указанных субрегионов гиппокампа Tg-PA и Tg-R3PA мозга ( p <0.05, непарный т тест). F . Количество бляшек, занятых на квадратный мм исследуемых срезов, также наносили на график, чтобы показать последовательное уменьшение амилоидных бляшек в коре Tg-R3PA, но не в области CA1. Открытая полоса представляет мышей PA, а закрытая полоса представляет мышей R3PA. Шкала: (в D ) A – D , 0,2 мм.

Как показано на фиг. 2 C , нагрузка бляшек Aβ во всем гиппокампе существенно не различалась у мышей Tg-R3PA и Tg-PA.Так как RIDN формируются в основном в области CA1 и меньше в области CA3 и зубчатой ​​извилины, дальнейшая количественная оценка этих подобластей была выполнена. Мы обнаружили, что только количество конденсированных бляшек Aβ в области CA1 мышей Tg-R3PA (обогащенных RIDN) не было значительно снижено по сравнению с таковым у мышей Tg-PA (34,0 ± 6,26 на 16 срезов против 47,3 ± 4,67 на 16 срезов). ; p > 0,05, непарный тест t ), тогда как количество бляшек было значительно снижено в CA3 мыши Tg-R3PA (19.2 ± 5,54 против 38,0 ± 3,46 на 16 секций; снижена на 49,5%, p <0,05) и области зубчатых извилин (50,4 ± 14,2 против 90,0 ± 5,03 на 16 секций; уменьшено на 44,0%; p <0,05) (рис.3 E ). Альтернативная количественная оценка, которая измеряет количество бляшек на квадратный миллиметр исследованных образцов, также продемонстрировала согласованность этих результатов (рис. 3 F ).

В совокупности мы показали здесь, что повышенный уровень RTN3 значительно снижает образование бляшек Aβ в головном мозге R3PA и большей части гиппокампа.Смещение ингибирующего эффекта в области CA1 гиппокампа за счет повышенной экспрессии RTN3, вероятно, связано с предварительно сформированными агрегатами RTN3 в RIDN. Ранее мы продемонстрировали, что наличие RIDN в гиппокампе мышей Tg-RTN3 коррелирует с образованием и уровнями агрегатов RTN3 (Hu et al., 2007), и что BACE1 не взаимодействует с агрегатами RTN3 (He et al., 2006). ). Хотя предполагается, что BACE1 также маркирует дистрофические нейриты (Zhao et al., 2007), мы обнаружили, что RIDN не перекрывались с дистрофическими нейритами, маркированными антителом BACE1 (данные не показаны), что указывает на то, что BACE1 и агрегированный RTN3 частично разделены на две части. разные популяции нейритных областей.Так как RIDN образовывались раньше, чем амилоидные бляшки в наших моделях на животных, преформированные RIDN, по-видимому, отрицательно влияли на процесс отложения амилоида в области CA1.

Снижение продукции Aβ у мышей Tg-R3PA

Уровни Aβ, особенно Aβ _1–42, регулируют процесс отложения амилоида при AD (Golde and Younkin, 2001; Sisodia and George-Hyslop, 2002; Tomita and Iwatsubo, 2004). Как ранее сообщалось в исследованиях на мышах с БА, Aβ _1–42 гораздо легче агрегировать, чем Aβ _1–40, , а агрегированные Aβ _1–42 и Aβ _1–40 растворяются в гидрохлориде гуанидина (Jankowsky и другие., 2004). Чтобы измерить уровни Aβ _1–40 и Aβ _1–42 с помощью сэндвич-ELISA, общий Aβ экстрагировали из указанных образцов мозга мышей с помощью метода гидрохлорида гуанидина, как описано ранее (Wang et al., 2006). Уровни Aβ _1–40 (29,9 ± 1,97 против 39,6 ± 2,17 пмоль / г; p <0,05) и Aβ _1–42 уровней (377,4 ± 50,72 против 596,9 ± 14,68 пмоль / г; p <0,01 ) были значительно ниже в коре головного мозга мышей Tg-R3PA, чем у мышей Tg-PA (рис.4 А ). Примечательно, что соотношение Aβ _1–40 / Aβ _1–42 не изменилось (данные не показаны), что согласуется с нашим предыдущим наблюдением ингибирующих эффектов RTN3 на BACE1 in vitro (He et al., 2004 ). Уровни в гиппокампе нерастворимого Aβ _1–40 (39,4 ± 4,58 против 45,9 ± 6,44 пмоль / г; p = 0,229) и Aβ _1–42 (309,9 ± 42,60 против 364,3 ± 62,22 пмоль / г; p = 0,255) у мышей Tg-R3PA также были ниже, чем у мышей Tg-PA (рис.4 B ). Хотя, по-видимому, наблюдается меньшее снижение уровней Aβ, чем отложение амилоида, предыдущие исследования также показали аналогичные явления на других моделях животных, включая гетерозиготных мышей BACE1 (McConlogue et al., 2007). В целом, наши результаты ELISA коррелируют с иммуногистохимическими результатами, которые показывают снижение продукции и отложения Aβ в коре головного мозга мышей Tg-R3PA.

Продукция Aβ была снижена у мышей Tg-RTN3. A , B , Уровни нерастворимого Aβ _1–40 и Aβ _1–42 , экстрагированного из кортикальных ( A ) и всего гиппокампа ( B ) тканей измеряли с помощью сэндвич-ELISA.Значения Aβ выражены как средняя концентрация Aβ ± SEM в пмоль / г. В то время как наблюдается значительное снижение как нерастворимого Aβ _1–40 , так и Aβ _1–42 в коре Tg-R3PA, разница в значениях нерастворимого Aβ в гиппокампе между мышами Tg-PA и Tg-R3PA была более умеренной ( * p <0,05, ** p <0,01, n = 3; t тест).

Экспрессия трансгена RTN3 снижает продукты расщепления BACE1

Мы также выполнили вестерн-блот-анализ экстрактов общего белка из гомогенатов коры головного мозга мышей Tg-PA и Tg-R3PA (возраст 6 месяцев), чтобы изучить уровни C-концевого продукта CTF99, расщепленного BACE1, который оценивали с помощью антител. узнавая либо конец Aβ N (6E10), либо конец APP C (A8717).Следует отметить, что полноразмерный APP мозга и секретируемые N-концевые фрагменты не были разделены на Вестерн-блоттинге. Общие уровни этих белков, по-видимому, существенно не изменились, что свидетельствует о том, что экспрессия АРР у мышей Tg-R3PA сравнима с таковой у мышей Tg-PA. В то время как уровень RTN3 был подтвержден как примерно в 4 раза выше в Tg-R3PA головного мозга, уровень APP CTF99 был заметно снижен, особенно когда 6E10 использовался для обнаружения человеческого APP CTF99 (фиг. 5 A ). Это небольшое снижение было четко продемонстрировано при сравнении соотношений CTF99 и CTF83 (1.97 ± 0,07 против 1,64 ± 0,12; p <0,05, n = 4) или общий APP (0,96 ± 0,04 для Tg-R3PA против 0,73 ± 0,07 для Tg-PA; p <0,05, n = 4). Напротив, общие уровни CTF99 в гиппокампе не были значительно снижены, что согласуется с морфологическими результатами и результатами Aβ (рис. 5 B ) (CTF99 / APP: 1,31 ± 0,07 в Tg-R3PA против 1,26 ± 0,03 в Tg-PA; p <0,05, n = 4). Таким образом, пониженное отложение амилоида у мышей R3PA объясняется сниженной активностью BACE1 у мышей R3PA и предварительно сформированными RIDN, влияющими на негативную модуляцию RTN3 при обработке APP.

паттернов обработки APP в мозге мышей Tg-PA и Tg-R3PA. A , B , равные количества белковых экстрактов из коры головного мозга ( A ) или гиппокампа ( B ) 180-дневных мышей Tg-PA и Tg-R3PA были исследованы методом вестерн-блоттинга. Антитело 6E10 распознает полноразмерный APP и продукт трансгена человеческого APP CTF99, расщепленный BACE1. BACE1 выявляется с помощью антитела B279. Антитело A8717, специфичное к C-концу APP, использовали для обнаружения полноразмерного APP, его фрагментов CTF99 и CTF83.Антитела, распознающие β-актин и калнексин, использовали для проверки равной нагрузки.

Измененная локализация BACE1 в субклеточных компартментах после сверхэкспрессии RTN3

Хотя оба наших исследования in vitro и in vivo продемонстрировали, что повышенная экспрессия RTN3 будет связываться и отрицательно влиять на активность BACE1, препятствуя доступу BACE1 к его субстрату APP, физиологическая функция RTN3 во время его взаимодействия с BACE1 все еще остается не понятно.Для дальнейшего решения этого механистического вопроса мы протестировали потенциальную роль RTN3 в клеточном трафике, как обсуждалось ранее (Wakana et al., 2005). Мы предположили, что клеточное распределение BACE1 будет затронуто, если повышенная экспрессия RTN3 изменит трафик BACE1. Чтобы исследовать потенциальное влияние RTN3 на внутриклеточную локализацию BACE1, мы сначала выполнили центрифугирование в градиенте сахарозы для фракционирования клеточных компартментов клеток HEK-293 и HR3M. Клетки HR3M были созданы путем стабильной экспрессии RTN3 в клетках HEK-293 (He et al., 2007). Наш результат показал, что в клетках HR3M большая часть BACE1 локализована во фракциях ER, оставляя небольшое количество BACE1 во фракциях Golgi (Fig. 6 A ). Напротив, значительная часть BACE1 была локализована в Golgi клеток HEK-293 (фракции 3 и 4), а гораздо меньшая часть была локализована в ранних эндосомах (фракция 2), что согласуется с предыдущими сообщениями (Creemers et al. ., 2001; Ян и др., 2001; Пасторино и др., 2002). Мы также обнаружили, что эндогенные уровни APP, детектируемые с помощью антитела A8717, были в основном во фракциях, содержащих ER и белки плазматической мембраны в обоих случаях, но были более очевидными в клетках HR3M.Следует отметить, что уровни полноразмерных APP были выше в клетках HR3M, чем в клетках HEK-293, что согласуется с нашими предыдущими сообщениями о том, что повышенная экспрессия RTN3 повышает уровни полноразмерных APP в культивируемых клетках (He et al., 2004 ) и седалищных нервов (Shi et al., 2009).

Измененное клеточное распределение BACE1 после сверхэкспрессии RTN3. A . После трансфекции плазмидной ДНК, экспрессирующей ВАСЕ1, в течение 24 часов клетки HEK-293 и HR3M гомогенизировали и постнуклеарный супернатант фракционировали в равновесном градиенте сахарозы.Фракции (12 × 1 мл) собирали сверху градиента, 400 мкл каждой фракции осаждали ледяным метанолом, затем белки разделяли на 4–12% гелях Bis – Tris NuPAGE с последующим иммуноблоттингом с использованием антител против BACE1 (B279), APP (C-терминал APP) и RTN3 (R458), как указано. Калнексин, β-COP, TGN38 и EEA1 служили белковыми маркерами для ER, Golgi, trans -Golgi network (TGN) и ранней эндосомы (EE), соответственно. Маркеры молекулярной массы указаны в килодальтонах слева на панели. B , клетки HM, которые стабильно экспрессируют BACE1, трансфицировали RTN3 или пустым вектором в течение 48 часов, и клетки подвергали субклеточному фракционированию с помощью градиента йодиксанола. Измененное обогащение BACE1 в ранних эндосомных компартментах является наиболее заметным. Измененные полосы белка, распознаваемые C-концевым антителом APP, также указаны стрелкой. Этот фрагмент белка не обнаруживался в клетках HEK-293, которые использовали для генерации клеток HM. Было указано обогащение EEA1 (ранний эндосомальный маркер), β-COP (маркер компартмента Гольджи) и калнексина (ER).

Для дальнейшего подтверждения этого наблюдения мы трансфицировали либо пустой вектор, либо конструкцию экспрессии RTN3 в клетки HM, которые стабильно экспрессируют BACE1. После трансфекции в течение 48 часов эти клетки подвергали субклеточному фракционированию с использованием метода градиента йодиксанола в соответствии с процедурами, описанными ранее (Xia et al., 1998). Мы обнаружили, что BACE1 демонстрирует бимодальное распределение во фракциях ER и Golgi в ​​клетках, трансфицированных контролем, но значительно больше BACE1 было обогащено в компартментах ER, когда RTN3 был значительно сверхэкспрессирован (рис.6 B ).

Ранее было показано, что небольшой процент BACE1 обнаруживается на поверхности клетки (Huse et al., 2000; Yan et al., 2001; Kinoshita et al., 2003; Hu et al., 2006; Zou et al., ., 2007). Потенциально повышенное удержание BACE1 в отсеке ER может снизить поверхностную экспрессию BACE1. Чтобы проверить эту возможность, мы сравнили локализацию BACE1 на клеточной поверхности в клетках HEK-293 или клетках HR3M с использованием биотинового мечения поверхностных белков. Чтобы подтвердить это, мы временно трансфицировали эти две клеточные линии равными количествами HA-меченой конструкции экспрессии BACE1 человека, и трансфекции позволяли продолжаться в течение 24 часов.Затем белки клеточной поверхности биотинилировали, как описано ранее (Yan et al., 2001), и биотинилированные белки специфически удаляли с помощью гранул нейтравидина для вестерн-блоттинга. Хотя экспрессия HA-меченного BACE1 в клетках HR3M была аналогична экспрессии в клетках HEK-293, отношение поверхностного BACE1 к общему клеточному BACE1 было значительно ниже в клетках HR3M по сравнению с клетками HEK-293 (фиг.7 A ). . Основываясь на количественной оценке в трех независимых сериях экспериментов, мы обнаружили, что 5.49 ± 0,679% общего клеточного BACE1 в клетках HEK-293 было обнаружено на поверхности клетки, но только 1,36 ± 0,0694% общего BACE1 в клетках HR3M было обнаружено на поверхности клетки, что отражает уменьшение на 55% поверхности BACE1 после увеличения экспрессия RTN3 (рис.7 B ) ( p <0,01, n = 3). В альтернативном эксперименте клетки НМ, стабильно экспрессируемые ВАСЕ1, временно трансфицировали либо плазмидной ДНК RTN3, либо пустым вектором в течение 48 часов. Эксперименты по биотинилированию и вытеснению проводили таким же образом, как указано выше.В соответствии с данными, изложенными выше, мы наблюдали значительное снижение поверхностного BACE1 в клетках после сверхэкспрессии RTN3 (фиг. 7 D , E ). Процент поверхностного ВАСЕ1 в общем ВАСЕ1 составлял 7,67 ± 0,649% в контроле, тогда как он снижался до 3,40 ± 0,486% при сверхэкспрессии RTN3.

Уменьшение клеточной поверхности BACE1 после сверхэкспрессии RTN3. A , Вектор, экспрессирующий BACE1 человека, временно трансфицировали в клетки HEK-293 (293) и клетки HEK-293, сверхэкспрессирующие RTN3 (HR3M), с последующим биотинилированием поверхностных белков в живых клетках в соответствии со стандартными процедурами.Биотинилированные поверхностные белки были отделены от небиотинилированных белков с использованием гранул нейтравидина. Суммарные белки клеточных лизатов и биотинилированные белки анализировали на Вестерн-блоттинге с использованием специфических антител. С каждой клеточной линией было проведено три независимых эксперимента и проанализировано на одном и том же блоте. Калнексин служил контролем загрузки. B , C , Общие клеточные и поверхностные уровни BACE1 ( B ) и APP ( C ) были рассчитаны как интегрированное значение плотности (IDV) и нормализованы к IDV. калнексина.Процентное содержание двух белков на поверхности клетки представлено соответственно в виде гистограмм. Результаты были обобщены из трех серий экспериментов ( p <0,01). D , клетки НМ, экспрессирующие BACE1, временно трансфицировали плазмидной ДНК RTN3 или вектором pcDNA3.1 (помеченным как вектор) в течение 48 часов. Биотинилирование поверхностного белка и нейтравидиновый отбор выполняли тем же способом, что и описанный выше. Стоит отметить, что без биотинилирования поверхностные белки не были обнаружены в элюатах из колонки с нейтравидином. E , F . Общие клеточные и поверхностные уровни BACE1 ( E ) и APP ( F ) также были рассчитаны как IDV и нормализованы к IDV калнексина. Процентное соотношение двух белков на поверхности клетки к их общему количеству белков в лизатах соответственно представлено в виде столбчатых диаграмм ( E ) и ( F ). ( n = 6; p <0,05).

Ожидается, что более высокие уровни RTN3 уменьшат обработку BACE1 приложения.В соответствии с этим, общий полноразмерный APP действительно был значительно выше в клетках HR3M, чем в клетках HEK-293 ( p <0,01, n = 3, t тест) (Рис.7 A , D ). Мы также подтвердили, что уровни мРНК APP в этих двух клеточных линиях были схожими (данные не показаны), тем самым подтверждая, что этот повышенный уровень полной длины APP вызван сниженным процессингом BACE1, как обсуждалось ранее (He et al., 2004 ; Murayama et al., 2006). Интересно, что клеточный трафик APP также был изменен, о чем свидетельствует измененное субклеточное фракционирование (рис.6 A ) и процентное содержание APP на поверхности клетки (рис.7 C , F ) ( p <0,01, n = 3). Этот сниженный поверхностный уровень АРР в клетках соответствовал наблюдению фракционирования по градиенту сахарозы.

В целом, мы продемонстрировали, что повышенная экспрессия RTN3 действительно изменяет клеточный трафик BACE1 и APP. Повышенное удерживание BACE1 в отсеке ER также не способствует оптимальной переработке APP BACE1, что требует кислой среды pH.В отличие от BACE1, на перенос APP через мембрану могла косвенно повлиять повышенная экспрессия RTN3, поскольку прямое взаимодействие между RTN3 и APP не было обнаружено. Способствует ли измененное взаимодействие между BACE1 и APP после избыточной экспрессии RTN3 измененному клеточному перемещению APP, еще предстоит исследовать.

Обсуждение

RTN представляют собой группу интегральных мембранных белков, преимущественно связанных с ER (Oertle et al., 2003; Yan et al., 2006). Хотя их биологические функции остаются плохо изученными, различные биохимические и функциональные исследования предполагают различные потенциальные роли этих белков, включая формирование канальцевого ER, регулируемый перенос белков везикул, рост нейритов и экзоцитоз (Chen et al., 2000; GrandPré et al. al., 2000; Steiner et al., 2004; Voeltz et al., 2006; Hu et al., 2007; Киселева и др., 2007). Измененные уровни экспрессии RTN обнаруживаются при различных болезненных состояниях, включая неврологические расстройства (Bandtlow et al., 2004; Фергани и др., 2005; Ян и др., 2006). Мы и другие продемонстрировали, что RTN взаимодействуют с BACE1 и негативно модулируют активность протеазы BACE1 (He et al., 2004, 2006; Murayama et al., 2006; Wojcik et al., 2007; Kume et al., 2009). В настоящем исследовании мы также продемонстрировали, что повышенная экспрессия RTN3 в наших моделях мышей значительно снижает продукцию Aβ, отложение амилоида и нагрузку на бляшки. В частности, сверхэкспрессия RTN3 у мышей Tg-R3PA значительно уменьшала количество нейритных бляшек Aβ на ∼55% в коре головного мозга, на 50% в области CA3 и на 44% в области зубчатой ​​извилины по сравнению с теми же областями в Tg. -ПА мыши.Однако наши результаты являются первыми, которые предполагают, что предварительно сформированные RIDN в основном в области Tg-R3PA CA1 отрицательно влияют на негативную модуляцию BACE с помощью RTN, тем самым влияя на процесс отложения амилоида. Существует множество потенциальных механизмов, которые могут вызывать образование дистрофических нейритов у пациентов с БА, и образование RIDN коррелирует с образованием агрегатов RTN3. Наши результаты предполагают, что ингибирование агрегации RTN3 уменьшит образование RIDN и отложение амилоида при AD.

RIDNs у мышей Tg-RTN3 возникают уже в возрасте 3 месяцев (Shi et al., 2009), что раньше, чем начало образования бляшек Aβ у мышей Tg-PA (возраст ~ 5-6 месяцев). Область СА1 гиппокампа является преобладающей областью этого образования. В нашем исследовании уровни экспрессии RTN3 в гиппокампе и коре головного мозга были сопоставимы (рис. 1), хотя большинство RIDN развились в области CA1 гиппокампа, и только несколько RIDN были разбросаны в коре головного мозга. Наблюдаемое биохимическое различие между гиппокампом и корой головного мозга, возможно, связано с существованием большого количества агрегатов RTN3 в гиппокампе, но не в коре головного мозга мышей Tg-R3PA (Hu et al., 2007). Остается определить, почему гиппокамп более чувствителен к образованию агрегатов RTN3. Однако из-за этого различия общий положительный эффект сверхэкспрессии RTN3 был значительно снижен в гиппокампе мышей Tg-R3PA, поскольку уровни нерастворимого Aβ _1–40 и Aβ _1–42 , а также количества дистрофического Aβ бляшки были опущены в меньшей степени. Недавно мы продемонстрировали, что агрегированный RTN3 не взаимодействует с BACE1, тогда как свободная форма RTN3 связывается с BACE1 и ингибирует его (He et al., 2006), указывая на то, что мономерный статус является критическим для ингибирующей функции BACE1 в отношении RTN3. RTN3 принимает ω-образную структуру с двумя концами, обращенными к цитозольной стороне (He et al., 2007), и его C-концевой мотив QID (глутамин, изолейцин, аспарагиновая кислота) необходим для взаимодействия с C-концевой мембраной BACE1. -проксимальная область (He et al., 2006). Взаимодействие RTN3 с BACE1 необходимо для ингибирующей роли RTN3 в ослаблении BACE1-опосредованного процессинга APP. Поскольку основным компонентом RIDN является агрегированный RTN3, образование RIDN в большом масштабе снижает доступный мономер RTN3 внутриклеточно, что, в свою очередь, освобождает BACE1 от RTN3-опосредованного ингибирования.

Если преформирование RIDN в гиппокампе мышей можно избежать, индукция экспрессии RTN3 может быть альтернативным подходом для достижения уменьшения отложения амилоида. Мы обнаружили, что сверхэкспрессия RTN3 в областях, отличных от CA1, в достаточной степени вызвала уменьшение образования амилоидных бляшек, хотя и не полностью блокировала продукцию Aβ. Было показано, что частичное снижение активности BACE1 снижает отложение амилоида (Laird et al., 2005; Singer et al., 2005; McConlogue et al., 2007), и наши результаты согласуются с этими наблюдениями.Следует также отметить, что модель APP, использованная в настоящем исследовании, отличается от мышей PDAPP или Tg-2576, использованных в вышеуказанных публикациях, но обычно считается, что ингибирование BACE1 снижает отложение амилоида.

Механизм, с помощью которого повышенная экспрессия RTN3 снижает процессинг BACE1 APP, был исследован путем тестирования потенциальной роли RTN3 в транспортировке мембранных белков. Генетические исследования показывают, что семейство белков RTN может формировать трубчатые структуры (Voeltz et al., 2006; Tolley et al., 2008), но другие исследования показывают, что RTN-белки могут влиять на транспорт везикул посредством взаимодействия с белками-переносчиками везикул (Iwahashi and Hamada, 2003; Steiner et al., 2004; Wakana et al., 2005; Liu et al. , 2008). Наше настоящее исследование показало, что повышенная экспрессия RTN3 вызывает удержание большего количества BACE1 в компартментах ER и снижает перенос BACE1 на поверхность клетки. Возможное объяснение этого измененного трафика состоит в том, что RTN3 не является быстро подвижной молекулой транспорта ER, а взаимодействие между RTN3 и BACE1 заставляет BACE1 медленно переходить из ER в поздние секреторные компартменты.В соответствии с этим наблюдением мы обнаружили, что поверхность BACE1 значительно уменьшалась, когда RTN3 был сверхэкспрессирован. Интересно, что на клеточный трафик APP также влияет избыточная экспрессия RTN3 (фиг. 6, 7). Хотя RTN3 не взаимодействует с APP напрямую, основываясь на наших экспериментах по совместному IP (He et al., 2004), повышенное удержание APP в ER может быть связано с повышенными уровнями BACE1 в ER в этом случае и взаимодействием между APP и BACE1 может косвенно сохранить больше APP в ER.Повышенное удержание APP в ER объясняет несколько сниженные уровни CTF83, продукта обработки APP α-секретазой, как показано на рисунке 1.

Ожидается, что изменение внутриклеточного транспорта и локализации BACE1 повлияет на метаболизм АРР и продукцию Aβ. Обычно большая часть BACE1 присутствует в сети trans -Гольджи и эндосомах, тогда как остальная часть находится на поверхности клетки и в ER (Vassar et al., 1999; Lin et al., 2000; Creemers et al. , 2001; Walter et al., 2001; Ян и др., 2001). Расщепление APP по β-сайту с помощью BACE1 происходит как в ранних секреторных компартментах, так и в эндоцитарных путях (Shi et al., 2001; Yan et al., 2001; Huse et al., 2002; Kinoshita et al., 2003; He et al., др., 2005). Следовательно, больше BACE1 накапливается в среде ER, в которой процессинг APP BACE1 находится в менее благоприятных условиях pH, как предполагалось ранее (Hussain et al., 1999; Sinha et al., 1999; Vassar et al., 1999; Yan et al., 1999; Lin et al., 2000). Ожидается, что повышенное удержание BACE1 в ER усилит деградацию BACE1, как было недавно предложено (Tesco et al., 2007). Возможно, тесное взаимодействие RTN3 с BACE1 предотвращает не только доступ BACE1 к его субстрату APP для правильной обработки, но и его деградацию. В то время как повышенные уровни RTN3 могут удерживать BACE1 в отсеке ER, неясно, требуется ли для выхода BACE1 из отсека ER RTN3. Полный дефицит RTN3 и членов его семейства будет протестирован для решения этого вопроса.

Таким образом, наши результаты установили двойную роль RTN3 in vivo , и наши результаты предполагают, что измененный клеточный трафик BACE1 in vitro и in vivo также может объяснить снижение продукции Aβ и его отложение в головной мозг.Важно отметить, что наши результаты также показывают, что предварительно сформированные RIDN будут неблагоприятно способствовать продукции Aβ, и более высокие уровни RIDN, чем амилоидные бляшки, уже были обнаружены в области гиппокампа посмертного мозга при БА (Shi et al., 2009). Следовательно, предотвращение образования RIDN будет необходимым шагом для усиления эффекта RTN3 на отложение амилоида.

Сноски

• Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения Р.Ю. (AG025493) и награды от Фонда Ральфа Уилсона и Ассоциации Альцгеймера Р.Y. Q.S. частично поддерживается премией молодых исследователей от Национального альянса по исследованию шизофрении и депрессии и M.P. поддерживается постдокторской стипендией Американского фонда помощи в области здравоохранения. Мы благодарим доктора Сяндун Чжоу за большую помощь во время исследований и Криса Нельсона за критическое прочтение этой рукописи. Доктор Роберт Вассар (Северо-Западный университет) предоставил нам BACE1-специфическое моноклональное антитело, которое использовали для конфокального окрашивания BACE1 в образцах мозга.

• Переписку следует направлять доктору Рицян Яну, Отдел неврологии, Исследовательский институт Лернера, Фонд клиники Кливленда, 9500 Евклид-авеню, Кливленд, Огайо, 44195. yanr {at} ccf.org

От непептидов к ингибиторам неуглеродных протеаз: металлакарбораны как специфические и сильные ингибиторы протеазы ВИЧ

Abstract

Протеаза (PR) ВИЧ представляет собой главную мишень для рационального дизайна лекарств, а ингибиторы протеазы (PI) являются мощными противовирусными препаратами.Большинство существующих ИП представляют собой псевдопептидные соединения с ограниченной биодоступностью и стабильностью, и их использование затруднено из-за высокой стоимости, побочных эффектов и развития устойчивых штаммов. В нашем поиске новых структур PI мы определили группу неорганических соединений, икосаэдрических металакарборанов, как кандидатов в новый класс непептидных PI. Здесь мы сообщаем о мощном, специфическом и селективном конкурентном ингибировании PR ВИЧ замещенными металлакарборанами. Наиболее активное соединение, натрий-водород-бутилимино-бис-8,8- [5- (3-окса-пентокси) -3-кобальт бис (1,2-дикарболлид)] диат, показал значение K _i . из 2.2 нМ и субмикромолярный EC ₅₀ в противовирусных тестах, не показали токсичности в культуре тканей, слабо ингибировали человеческий катепсин D и пепсин и были неактивны в отношении трипсина, папаина и амилазы. Структура исходного бис (1,2-дикарболлида) кобальта в комплексе с PR ВИЧ была определена с разрешением 2,15 Å с помощью кристаллографии белков и представляет собой первую определенную структуру карборан-белкового комплекса. Он показывает следующий способ ингибирования PR: две молекулы исходного соединения связываются с гидрофобными карманами в проксимальной к лоскуту области S3 и S3 ‘субсайтов PR.Поэтому мы предлагаем, чтобы эти соединения блокировали закрытие клапана в дополнение к заполнению соответствующих карманов для связывания, как обычные ИП. Этот тип связывания и ингибирования, химическая и биологическая стабильность, низкая токсичность и возможность введения различных модификаций делают кластеры бора привлекательными фармакофорами для сильного и специфического ингибирования ферментов.

Протеаза ВИЧ (PR) отвечает за расщепление предшественников вирусных полипротеинов на зрелые функциональные вирусные ферменты и структурные белки.Этот процесс, называемый созреванием вируса, необходим для того, чтобы вирион-потомок стал репликационно-компетентным и заразным. Химическое ингибирование или инактивация путем мутации PR блокирует инфекционность вируса (1). Таким образом, PR стал основной целью терапевтического вмешательства при СПИДе. Академические и промышленные исследования привели к быстрой разработке восьми эффективных ингибиторов, которые в настоящее время используются в клинической практике, а несколько других все еще находятся в стадии разработки (для обзора см. Ссылки 2 и 3).

Несмотря на значительный успех рационального дизайна лекарств, потребность в эффективных ингибиторах PR (ИП) все еще актуальна.Большинство современных ИП представляют собой псевдопептидные соединения с ограниченной биодоступностью и стабильностью. Более того, их клиническое использование затруднено из-за высокой стоимости производства, различных побочных эффектов и быстрого развития устойчивых вирусных штаммов (4). Следовательно, существует постоянная потребность в разработке новых ИП с упором на широкую специфичность против устойчивых к ИП мутантов ВИЧ (5, 6).

Молекулярное моделирование и / или случайное тестирование библиотек соединений выявили несколько ингибиторов PR с неожиданной структурой.Большинство ИП первого поколения были псевдопептидами. Некоторые недавние соединения включают непептидные структуры, такие как циклические мочевины, сульфаниламиды и т. Д. (2). Однако даже неорганические соединения, Nb-содержащие полиоксометаллаты, специфически ингибируют PR ВИЧ с субмикромолярными значениями EC ₅₀ в тканевых культурах (7). В этом случае было показано, что ингибиторы неконкурентоспособны, и модель предполагала связывание с катионным карманом на внешней поверхности лоскутов. Также имеются данные о соединениях с неожиданным химическим составом, способных воздействовать на активный центр фермента.Было показано, что PR-связывающая щель ВИЧ вмещает фуллерены C ₆₀ , гидрофобные и электрофильные сферические соединения, а некоторые производные фуллерена действительно являются слабыми ингибиторами PR ВИЧ (8-11).

Мы искали другие типы нетрадиционных химических структур, которые могли бы вписаться в PR-связывающую щель, были бы биологически стабильными и обеспечивали бы легкую химическую модификацию. При скрининге ряда структурных мотивов мы идентифицировали группу неорганических соединений, икосаэдрических боранов, карборанов, а именно 12-вершинные металлические бис (дикарболлиды), как многообещающие каркасы для нового класса непептидных ИП.Эти бор / углеродные кластеры представляют собой многогранники, основанные на трехмерном каркасе с треугольными гранями.

Борсодержащие полиэдрические соединения интенсивно изучаются в связи с их использованием в борной нейтронно-захватной терапии (12) и в радиовизуализации (13, 14). Со структурной точки зрения множество известных структурных типов боранов, гетероборанов и металлоборанов представляет собой интересный аналог органических соединений, особенно ароматических соединений. Поскольку икосаэдрическая клетка лишь немного больше, чем огибающая вращения фенильного кольца, карбораны использовались в качестве стабильных гидрофобных фармакофоров (например,г., исх. 15-17). Информации об использовании карборанов в качестве ингибиторов ферментов мало. Немногочисленные примеры, приведенные в литературе, включают бензолактамы, содержащие дикарба-, клозо -додекаборан (16, 18) или карборановое замещение фенильного кольца в фенил-фталимидоимиде, что дает модулятор фактора некроза опухоли-α с активностью, сравнимой с исходным соединением. (19). Порфирины, замещенные дикарба-, клозо -додекаборанами, были обнаружены как ингибиторы PR ВИЧ с IC ₅₀ в субмикромолярном диапазоне (20).

Наше основное внимание было сосредоточено на ионных бис (дикарболлидах) металлов, которые состоят из двух субкластеров дикарболлидов, окружающих центральный атом металла. В бис (дикарболлидах) металлов равные 11-вершинные подкластеры дикарболлидов соединены металлической вершиной commo , образуя два 12-вершинных подкластера металлических дикарболлидов. Эти closo 26-электронные соединения с «арахисоподобной 12-вершинной геометрией» были описаны еще в 1965 году Хоторном и др. . (21) и, таким образом, образуют основные камни в химии металлакарборанов.

Среди других металлакарборанов переходных металлов (22), бис (1,2-дикарболлид) ион кобальта (23) демонстрирует некоторые уникальные особенности: синтетическую доступность, широкие возможности экзо -скелетных модификаций, высокую стабильность, делокализацию заряда, низкую нуклеофильность. , сильная кислотность сопряженных кислот и высокая гидрофобность. Эти свойства отражаются в уникальных свойствах раствора и образовании пар этого иона, что, в свою очередь, привело к его известным приложениям в экстракционной химии (24, 25), а также к разработке низкокоординируемых анионов (26) и соединений для радиовизуализации (14). ).Однако бис (дикарболлиды) металлов никогда не рассматривались как биологически активные соединения или фармакофоры.

В этой статье мы сообщаем о мощном, специфическом и селективном ингибировании PR ВИЧ родительскими и замещенными металлакарборанами, а именно бис (1,2-дикарболлидами) кобальта. Мы предоставляем доказательства механизма действия этих соединений, демонстрируем их противовирусную активность в тканевых культурах, анализируем их связывание с ферментом с помощью рентгеновской кристаллографии и показываем потенциал этого класса соединений, чтобы стать новым фармакофором для ингибирования ферментов.

Материалы и методы

Химический синтез. Соединение 1 (таблица 1) было преобразовано в натриевую соль из коммерчески доступной цезиевой соли (Katchem, Rez u Prahy, Чешская Республика) с использованием процедуры экстракции, описанной в ссылке. 27. Соединение 2 было получено прямым гидроксилированием 1 с использованием теплой разбавленной серной кислоты в соответствии с процедурами, описанными в ссылке. 28. Исходное промежуточное соединение диоксаната получали, как описано в ссылке.29. Синтез соединений 3-6 описан в Вспомогательные материалы и методы , который опубликован в качестве вспомогательной информации на веб-сайте PNAS.

Ферменты. Экспрессия, рефолдинг и очистка PR ВИЧ-1, PR ВИЧ-2 и варианта PR ВИЧ-1 (Q7K, L33I, L63I), несущего три мутации, которые минимизируют автопротеолитическое расщепление (30), были выполнены, как описано (31 ). PR из интрацистернальных А-частиц мыши (MIA14 PR) (32), катепсина D человека и пепсина получали, как описано (33, 34).Свиной α-амилазу, бычий трипсин и папаин были приобретены у Sigma.

Анализы ингибирования. Подавление PR ВИЧ. Значения IC ₅₀ и K _i определяли спектрофотометрическим анализом с хромогенным субстратом KARVNleNphEANle-NH ₂ , как описано (31). Константы ингибирования оценивали с использованием уравнения конкурентного ингибирования в соответствии с исх. 35. Механизмы ингибирования были получены из начальных скоростей реакции в зависимости от концентраций субстрата в присутствии различных концентраций ингибитора с использованием графика Лайнуивера-Берка.

Ингибирование протеазы MIA14. Спектрофотометрический анализ использовали для определения характеристик ингибирования с использованием хромогенного субстрата DSAYNphVVS, как описано (32).

Ингибирование человеческого катепсина, пепсина, трипсина, папаина и α-амилазы. Подробнее об экспериментах см. Вспомогательные материалы и методы .

Тестирование противовирусной активности в тканевых культурах. Противовирусную активность анализировали с использованием клеток PM-1, инфицированных штаммом ВИЧ-1 NL4-3, модифицированным по опубликованной методике (36).Клетки PM-1 инфицировали сокультивированием и промывали через 4 часа после заражения, и после промывки добавляли соединения , 1-6, или растворитель ДМСО, соответственно. Новый продуцируемый вирус собирали через 48 часов после инфицирования и очищали коротким центрифугированием, и инфекционный титр определяли на клетках TZM, которые экспрессируют β-галактозидазу с Tat-чувствительного промотора. Титры вирусов и стандартные отклонения получены в трех независимых экспериментах.

Кристаллизация, сбор данных и структурное решение. Комплекс для кристаллизации получали смешиванием PR ВИЧ-1 (Q7K, L33I, L63I) с 3,7-кратным молярным избытком соединения 1 , растворенного в ДМСО, и концентрировали ультрафильтрацией до конечной концентрации 7,5 мг / мл. Кристаллы выращивали методом диффузии паров висячей капли при 19 ° C с использованием 0,1 М трис · HCl (pH 8,5) и 2,0 М дигидрофосфата аммония в качестве раствора для осаждения. Дифракционные данные собирали при 100 K с использованием синхротронного излучения с длиной волны 0.8 Å [канал X13, Deutsches Elektronen-Synchrotron (DESY), Гамбург, Германия] и были обработаны с использованием пакета программ hkl 2000 (37). Структура PR ВИЧ была решена путем молекулярной замены с использованием белковых координат из Protein Data Bank (PDB) структуры 1NH0 (38). Решение и уточнение структуры проводились с помощью пакета программ ccp4.

Параметры кристалла и статистика сбора данных сведены в Таблицу 2. Координаты атомов и структурные факторы депонированы в PDB: код 1ZTZ.Подробности определения структуры приведены в Таблице 4, которая опубликована в качестве вспомогательной информации на веб-сайте PNAS.

Результаты и обсуждение.

Дизайн и синтез ингибитора. Большинство ИП ВИЧ, используемых в настоящее время в клиниках, представляют собой псевдопептиды или пептидные миметики, основанные на ограниченном количестве структурных строительных блоков. Наше намерение состояло в том, чтобы идентифицировать новые основные структуры и, таким образом, расширить химическое пространство, доступное для разработки ИП с новыми качествами.Мы определили 12-вершинные металлокарборановые кластеры как подходящие гидрофобные, стабильные, нетоксичные структурные аналоги ароматических соединений. В наших первоначальных испытаниях замещенные металлакарбораны показали наиболее многообещающие результаты.

Наш синтетический подход начался с легкодоступного исходного бис (дикарболлида) иона кобальта 1 с получением либо 8-гидроксипроизводного 2 (28), либо бис (1,2-дикарболлида) 8-диоксан-3-кобальта (29 ) реагент 7 (см. рис.1). Затем этот реагент прореагировал в мягких условиях, что дало серию экзо -скелетно-модифицированных металлакарборановых кластерных анионов 3-6 для тестирования.Для синтеза соединений 3-6 использовали реакцию расщепления кольца 7 с помощью O — и N -нуклеофилов (см. Рис. 1), в результате чего образуются ионные частицы, если открывателем кольца является анион, и цвиттерионы бетаинового типа, если база не заряжена.

Реакция раскрытия цикла бис (1,2-дикарболлида) 8-диоксан-3-кобальта 7 различными нуклеофилами Nu ⁰ (например, NH ₃ ) и Nu ^— (например, , RO ^— ) с образованием цвиттерионных и анионных соединений соответственно.

Процедура раскрытия цикла цвиттер-иона 7 уже стала широко применяемым методом присоединения фрагмента бис (дикарболлида) кобальта к различным органическим веществам (39-41). Однако соединения 5 и 6 представляют собой примеры цвиттерионно-анионных структур, содержащих две субъединицы бис (1,2-дикарболлида) кобальта, связанные через гибкую органическую спейсерную цепь.

Константы ингибирования и противовирусная активность. Соединения 1-6 были протестированы как потенциальные ингибиторы ВИЧ PR in vitro и в тканевых культурах.Соответствующие константы ингибирования (значения K, , _и ) и противовирусные активности (значения EC ₅₀ ) сведены в Таблицу 1. Все соединения демонстрируют классическое конкурентное связывание (данные показаны в Вспомогательные материалы и методы и на рис. который публикуется в качестве вспомогательной информации на веб-сайте PNAS). Этот кинетический анализ предполагает, что тестируемый бис (дикарболлид) кобальта конкурирует с пептидным субстратом и, следовательно, связывается с активной щелью фермента.Это предположение подтверждено рентгеноструктурным анализом комплекса PR ВИЧ с соединением 1 (см. Ниже). Исходное соединение 1 демонстрирует сильное ингибирование in vitro и микромолярную противовирусную активность. Дериватизация соединения 1 гидроксильными и 2- (2-гидроксиэтокси) этоксигруппами дала соединения 2 и 3 , проявляющие гораздо более слабую активность in vitro и сопоставимые противовирусные активности в тканевых культурах. Простой визуальный осмотр размера соединений 1-3 (таблица 1) в сравнении с объемом закрытой формы активной щели PR ВИЧ привел к выводу, что эти соединения не будут иметь достаточных контактов с соответствующим связывающим субстратом. расщелины.Доступная для растворителя площадь соединения 1 более чем в два раза ниже по сравнению с типичным обычным псевдопептидом PI, лопинавиром (LPV). Однако рентгеноструктурный анализ разрешил это очевидное противоречие, показав, что для эффективного связывания с активной щелью PR необходимы две единицы ингибитора (см. Фиг. 2 и 3). Поскольку относительный молекулярный вес соединения -1 является одним из самых низких, когда-либо сообщаемых для ингибирования PR ВИЧ, он дает достаточно возможностей для дальнейшего улучшения посредством анализа структуры-активности, и поэтому оно было выбрано в качестве ведущего соединения в нашей серии исследований. металакарборановые ингибиторы PR ВИЧ.

Рентгеноструктурный анализ связывания соединения 1 с ВИЧ-PR. ( A ) Общая структура комплекса ВИЧ PR-соединение 1 . Димер PR представлен в виде ленты с двумя каталитическими аспартатами, показанными в виде стержней. Две молекулы соединения 1 представлены их поверхностями Ван-дер-Ваальса и моделью серого стержня с ионами кобальта, показанными в виде пурпурных сфер. Автопротеолитический пептидный продукт представлен в виде палочки. ( B ) Наложение комплекса PR-соединение 1 с комплексом PR-лопинавир и со свободной структурой PR.Комплекс протеазы с лопинавиром (код PDB ID 1MUI) представлен желтыми лентами, лопинавир показан в виде палочки, свободная структура PR (код PDB ID 1HHP) показана зелеными лентами, а цветовая кодировка для соединения PR 1 комплекса то же, что и в A .

Взаимодействия соединения 1 с аминокислотными остатками в соответствующем PR-связывающем кармане. ( A ) Связывание молекулы Cb1 соединения 1 PR-мономером A (красная пробирка).( B ) Связывание молекулы Cb2 соединения 1 PR-мономером B (синяя трубка). Соединение 1 представлено моделью стержня серого цвета, с кобальтом, показанным в виде пурпурной сферы. Остатки PR в контакте с соединением 1 представлены моделями палочек, а их доступные для растворителя поверхности окрашены зарядом атома (синий — положительный; красный — отрицательный). ( C ) Наложение двух соединений 1 -режим связывания. Цветовая схема и представление для PR такие же, как в A и B , а атомы в соединении 1 окрашены в цвет взаимодействующей PR-цепи.

Примерно 100-кратное улучшение значения K _i было достигнуто за счет увеличения боковой цепи соединения 3 в положении 8 клетки путем добавления 1,2-дифенил-2-гидрокси- этоксигруппа, давая соединение 4 с 20 нМ K _i . Связывание соединения было дополнительно улучшено в четыре раза за счет конструирования симметричного соединения 5 и, даже более того, за счет алкилирования вторичной аминогруппы бутильным фрагментом (соединение 6 ), которое представляет собой наиболее активный ингибитор из ряда соединений. , со значением K _i , равным 2.2 нМ и субмикромолярная противовирусная активность в культуре ткани. О способе связывания этого соединения и его взаимодействии с карманами связывания фермента можно судить по структуре исходного соединения 1 .

Поразительно, что соединение 6 показало ЕС ₅₀ для ингибирования ВИЧ-1 в культуре ткани 250 нМ, что в 10 раз лучше, чем наблюдаемое для структурно очень похожего соединения 5 . Напротив, значение K _i для ингибирования PR in vitro показало только 2-кратную разницу.Этот результат указывает на то, что тонкие различия в структуре могут привести к значительным изменениям активности, и предполагает, что дальнейшее преобразование этой новой группы ИП может значительно повысить их потенциал в качестве антиретровирусных препаратов.

Анализ процессинга полипротеина вестерн-блоттингом показывает дефект процессинга у вируса, выращенного в присутствии активных соединений (данные не показаны). Существенной токсичности тестируемых соединений в тканевых культурах не наблюдалось в диапазоне концентраций до 50 мкМ.

Тестирование специфичности и селективности. Селективность ведущего соединения 1 и более сильнодействующих соединений 4-6 была протестирована на панели из семи ферментов, включая PR из высокогомологичного вируса ВИЧ-2, PR из более отдаленно родственного ретровируса MIA 14, прототип человеческий аспарагиновый PR, катепсин D и пепсин, сериновый PR, трипсин, цистеиновый PR, папаин и амилаза, как представитель непротеолитических ферментов с анионной щелью в активном центре. Результаты сведены в Таблицу 3 в виде значений IC ₅₀ ; соответствующие значения K _и показаны в скобках, когда это необходимо.

. Все тестируемые соединения ингибируют гомологичные PR ВИЧ-2 и MIA PR. хотя и менее строго, что позволяет предположить, что они могут быть активны против мутировавших устойчивых видов PR, отобранных под давлением клинически используемых ИП у ВИЧ-положительных пациентов. Активность тестируемых соединений по отношению к катепсину D и пепсину на два порядка ниже по сравнению с PR ВИЧ-1 на уровне K, , _и .Тестируемые соединения существенно не ингибируют какой-либо другой анализируемый фермент.

Кристаллическая структура комплекса PR-соединение 1. Структура ВИЧ PR-соединение 1 комплекс определяли при разрешении 2,15 Å с коэффициентом R 17,6% и R _{свободным} 23,6%. Последняя модель включает димер PR (цепи A и B) с двумя молекулами соединения 1 , связанными в активном центре (обозначены Cb1 и Cb2 на фиг. 2 A ). Поскольку соединение 1 обладает высокой симметрией по форме, тем не менее, невозможно однозначно различить положения атомов углерода и бора на картах электронной плотности при 2.Разрешение 15 Å.

Если две молекулы соединения 1 связаны, общая конформация PR подобна открытой конформации, типичной для свободного PR. Большинство структур основанных на субстрате комплексов ингибиторов активного центра имеют створки, закрытые над активным центром. Однако PR в комплексе с 1 может быть наложен на структуру PR без лиганда [код PDB ID 1HHP (42)] со среднеквадратичным отклонением в положениях α-углерода 0,99 Å (рис. 2 B ). Лоскуты, очевидно, удерживаются в открытой конформации за счет связывания молекул ингибитора с проксимальной к лоскуту, «верхней» частью щели активного сайта (рис.2). Таким образом, структура свидетельствует о том, что неисследованный до сих пор класс ингибиторов демонстрирует неожиданный способ ингибирования. До сих пор открытая конформация лоскута сообщалась только для несвязанного PR, тогда как все связанные с ингибитором структуры PR HIV дикого типа демонстрируют конформацию закрытого лоскута. Здесь мы описываем структуру комплекса PR с относительно мощным ингибитором, однозначно связанным в открытой форме фермента. Поскольку конформация лоскута при PR функционально очень важна, это открытие может указывать на то, что механизм ингибирования этих соединений блокирует закрытие лоскута, а не заполняет специфические карманы связывания в щели активного сайта.

Соединение 1 связано в гидрофобных карманах, образованных боковыми цепями остатков PR Pro-81, Ile-84 и Val-82 и покрытых остатками лоскута Ile-47, Gly-48 и Ile-54 ( Рис.3). Эти карманы приблизительно соответствуют субсайтам связывания субстрата S3 и S3 ‘. Хотя сайт связывания ингибитора идентичен в обоих мономерах, положения двух молекул соединения 1 различаются (фиг. 3 C ). Молекула ингибитора Cb1 составляет 21 ван-дер-ваальсов контакт с семью остатками мономера A (рис.3 A ), тогда как молекула ингибитора Cb2 устанавливает 12 ван-дер-ваальсовых контактов с четырьмя остатками мономера B (рис. 3 B ). В среднем 84% контактов приходится на неполярные атомы ПР. Две молекулы Cb1 и Cb2 контактируют друг с другом с помощью 3 ван-дер-ваальсовых контактов. Соединение 1 теряет 89% своей общей доступной для растворителя поверхности при образовании комплекса, и хорошая комплементарность формы между субсайтами S3 и S3 ‘PR и молекулами соединения 1 иллюстрируется средним индексом объема зазора, равным 0.45. Этот результат немного ниже среднего значения для комплексов фермент-ингибитор (43).

Комплекс PR 1 , кристаллизованный в кристаллической форме C2, уникальной среди всех 169 структур PR ВИЧ, депонированных в PDB. В кристалле симметрично связанные PR-комплексы ориентированы друг к другу своими активными центрами. В результате такой кристаллической упаковки симметричные створки контактируют друг с другом, а молекулы соединения 1 находятся в контакте со своими партнерами по симметрии, а также со створками, принадлежащими соседней молекуле симметрии.Таким образом, помимо описанных выше контактов, взаимодействия соединения 1 с PR на основе кристаллических контактов можно наблюдать с остатками Gly-48, Gly-49, Ile-50 и Phe-53. Однако образование этих взаимодействий в растворе кажется маловероятным, поскольку сборка комплекса, состоящего из двух димеров PR и четырех молекул ингибитора, маловероятна.

Пять остатков PR, которые находятся в контакте с соединением 1 , часто мутируют в устойчивые к лекарствам варианты PR (Ile-47, Ile-48, Ile-54, Val-82 и Ile-84).На вопрос, влияет ли присутствие этих мутаций на связывание соединения 1 , необходимо ответить с помощью дальнейших биохимических и структурных исследований. Тем не менее, соединение 1 двумя разными способами связывается с двумя идентичными связывающими карманами, образованными мономерами A и B (фиг. 3 C ). Таким образом, мы можем ожидать, что соединение 1 способно адаптировать свое положение так, чтобы оно могло связываться в соответствующий карман, измененный мутациями.

В дополнение к двум молекулам ингибитора, непрерывная карта электронной плотности в нижней части активного сайта PR позволила моделировать тетрапептид Ala-Gly-Ala-Ala, который представляет собой продукт автопротеолитического расщепления PR, часто наблюдаемого во время сокристаллизации PR со слабыми ингибиторами активного центра.Затем продукт деградации PR обнаруживается в активном сайте вместо ингибитора (ссылка 46; код PDB ID 1SP5). Однако в настоящей структуре пептид и соединение 1 занимают разные сайты активной щели, и, следовательно, они могут связываться одновременно. Тем не менее, высокие температурные факторы атомов основной цепи пептида указывают на высокую подвижность и / или ее вероятную более низкую заселенность. Отсутствие электронной плотности для боковых цепей также предполагает, что в структуре присутствуют несколько пептидов, происходящих из трех возможных сайтов расщепления (44).Следовательно, мы предполагаем, что присутствие пептида в активном сайте не требуется для специфического связывания соединения 1 .

В заключение, мы показали, что кластеры бора представляют собой удобные строительные блоки, которые могут создавать важные взаимодействия с гидрофобными участками PR-сайта связывания ВИЧ. Рентгеноструктурный анализ комплекса металлаборан-PR дает убедительные доказательства о сайте связывания ингибитора и типе взаимодействия. Exo -замена скелета родительского металлоорганического кластерного тектона вводит дополнительные нековалентные взаимодействия, ведущие к резкому повышению эффективности и селективности ингибирования.Комбинация гидрофобных взаимодействий каркаса с заменами, допускающими специфические Н-связывание и кулоновские взаимодействия, может дополнительно повысить эффективность этого класса непептидных ингибиторов PR на основе неорганического каркаса. Химическая и биологическая стабильность, низкая токсичность и возможность введения гетероатомов в клетку или модификации полярных групп в боковых цепях делают кластеры бора очень привлекательными фармакофорами.

Благодарности

Мы благодарим Консорциум X13 по кристаллографии белков за доступ к их объекту в Deutsches Elektronen-Synchrotron (DESY), Гамбург; Томас Бэйс из Института неорганической химии, Рез-у-Праги, за измерения части спектров ЯМР; и Хиллари Хоффманн за критическую вычитку рукописи.Эта работа была поддержана грантом QLK2-CT-2001-02360 из 5-й структуры Европейской комиссии и грантом Министерства образования (MSMT) Чешской Республики в рамках программы 1M6138896301 «Исследовательский центр новых противовирусных и противоопухолевых препаратов. ” В дальнейшем проект был поддержан планами исследований AVZ40550506 и AV0Z40320502 (Академия наук Чешской Республики). Синтез новых соединений частично поддерживался Исследовательским центром LC523, «Перспективные неорганические материалы» (от MSMT).

Сноски

• ↵ ‡ P.C., M.K., and P.Ř. внес равный вклад в эту работу.

• ↵ ^†† Кому можно обращаться по адресу: Департамент аналитической химии, Институт химической технологии, Technická 5, 166 28 Прага 6, Чешская Республика. Электронная почта: vladimir.kral {at} vscht.cz. ^§§ Кому можно обращаться по адресу: Институт органической химии и биохимии Академии наук Чешской Республики, Flemingovo nam.2, 166 10 Прага 6, Чехия. Электронная почта: konval {at} uochb.cas.cz.

• Вклад авторов: P.C., M.K., V.K., B.G., J. Plešek и J.K. спланированное исследование; P.C., M.K., P.Ř., J. Brynda, J. Pokorná, J. Plešek, B.G., L.D.-M., M.M., J. Bodem, H.-G.K. и V.K. проведенное исследование; P.C., Z.O., J. Plešek, B.G., L.D.-M., J. Bodem, H.-G.K. и V.K. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; P.C., M.K., P.Ř., J. Brynda, Z.O., J.S., H.-G.K., V.K. и J.K. проанализированные данные; и P.C., P.Ř., B.G., H.-G.K. и J.K. написал газету.

• Сокращения: MIA, внутрицистернальные А-частицы мыши; PR, протеаза; ИП — ингибитор PR ВИЧ; PDB, Банк данных белков.

• Размещение данных: координаты атомов и структурные факторы были депонированы в банке данных белков, www.rcsb.org/pdb (код PDB ID 1ZTZ).

• Авторские права © 2005, Национальная академия наук

Доступно бесплатно в Интернете через опцию открытого доступа PNAS.

Кортни Торнбург | Профили RNS