Гк банное: Горнолыжный центр ГЛЦ «Банное» офицальный сайт Башкирия

Разное

Содержание

Гостинично-развлекательный комплекс «Монблан», озеро Банное

Адрес:  Республика Башкортостан, озеро «Банное», п. Зелёная поляна, ул. Курортная, 6.

Телефоны: +7 (3519)-47-33-00, 46-02-01; +7 (34772)-2-77-77, 2-77-71.

Гостиничный комплекс «Монблан» находится в республике Башкирии на всемирноизвестном озере Банное. Именно здесь идеальную обстановку для отдыха в летнее и зимнее время года создают горы, охраняющие чистейшее озеро от холодных ветров. «Монблан» очень выгодно расположен, всего в 2-х км от него находится популярный курорт горнолыжников «Металлург-Магнитогорск», а за 24 км от гостиничного комплекса — горнолыжный центр «Абзаково». Периодически здесь проходят разные соревнования, включая и международные. В период межсезонья, гости ГК «Монблан» могут воспользоваться услугами санатория «Якты-Куль» и насладиться насыщенной развлекательной программой. Такое решение экономически более выгодно и к нему прибегают многие.

«Монблан» является семейным курортом с огромным количеством услуг, рассчитанным на гостей среднего достатка, хотя ВИП-номера также в нем есть.

Для проживания отдыхающих отель Монблан предлагает уютные комфортабельные номера разного уровня в четырехэтажном корпусе. Более подробно о комплектации номеров:

  • Стандартный двухместный номер площадью 18 м кв. оснащен односпальной кроватью, диваном, телевизором, чайником, санузлом душевой кабиной (или ванной).
  • Номер типа «Студия»  является двухместным площадью 35 м кв. Он оснащен двуспальной кроватью, диваном, чайником, телевизором, санузлом, ванной или душевой кабиной.
  • Номер типа «Стандарт+» является шестиместным двухкомнатным номером площадью 53 м кв. Он оснащен двуспальной кроватью, диваном, телевизором, чайником, санузлом, душевой кабиной или ванной.
  • Номер типа «Люкс» — это двухкомнатный номер, рассчитанный на 2-4 места, площадью 53 м кв с двумя спальнями. Он укомплектован двуспальными кроватями, диваном, телевизором, чайником, санузлом, ванной или душевой кабиной.
  • VIP-номер является двухэтажным номером, рассчитанным на 2-6 мест, площадью 100 м кв. Номер оснащен двуспальной кроватью, диваном, санузлом, сауной, Интернетом, телевизором, чайником.

Услуги гостиничного комплекса Монблан

Для своих гостей отель Монблан приготовил много вариантов проведения отдыха, среди которых:

  • ресторан,
  • бильярд,
  • боулинг,
  • для детей игровая зона,
  • ночной клуб.

Основное, для чего сюда приезжают отдыхающие из многих стран — это посещение горнолыжных курортов, расположенных в непосредственной близости от отеля.

ГЛЦ «Металлург-Магнитогорск» популярен среди почитателей экстремальных видов спорта и других зимних видов спорта: 7 разноуровневых трасс, скоростной подъемник гондольного типа, трасса для новичков 300 м, бугельный подъемник, трасса хаф-пайп 60 м. 

ГЛЦ «Абзаково» с 15-ю трассами, бугельными подъемниками, уютными кафе на склонах, катком, катанием на снегоходах и т.д.

Для семейного отдыха прекрасно подходит аквапарк «Аквариум», находящийся в Абзаково, где можно проводить время круглый год. Он обладает большим бассейном, двумя подводными гейзерами, встречным течением, подводным массажем, двумя ваннами-джакузи, детским бассейном, большим «Торбоганом», горкой «Камикадзе». Для малышей есть Baby-Pool.

Питание в гостиничном комплексе «Монблан»

Отель «Монблан» располагает для удобства отдыхающих рестораном украинской кухни«Диканька», банкетным залом на 20 человек, караоке-баром. Банкетный зал оснащен и бильярдным столом.

Как добраться до гостиницы «Монблан»

Из Москвы до отеля Монблан можно доехать на поезде №094 с маршрутом Москва Казанская — Магнитогорск.

Из Челябинска, следуя на пассажирском поезде №603У с маршрутом Челябинск — Магнитогорск.

Из Уфы лучше воспользоваться поездом №675Й, следующим по маршруту Уфа — Сибай.

Затем от железнодорожного вокзала в городе Магнитогорске необходимо сесть на маршрутное такси, едущее до озера Банного и выйти на остановке «Зеленая поляна».

Для отдыхающих, забронировавших гостиничный номер минимум на 7 днейесть услуга трансфер.

Схема проезда к отелю Монблан:

Цены уточняйте по телефону. Здесь размещаются отзывы!

У границы Башкирии с Челябинской областью из-за непогоды застряла семья с двумя детьми

Более пяти часов в пробке на границе Башкирии и Челябинской области стоят автомобили. В одной из машин — семья с двумя детьми.

«Мы направлялись из Уфы домой, в Магнитогорск. В горах трасса была хорошая, сильный ветер начался на объездной в районе Белорецка, особенно, когда спустились на равнину.

Сейчас в пробке на повороте к озеру Банное. Впереди стоят около пяти фур, которые, как я предполагаю, уперлись в перемет и не могут проехать. Позади нас также грузовики около 20 штук. Некоторые пытались пробиться по встречке, но безуспешно. Продолжает дуть сильный ветер, вокруг машин образуются сугробы», — сообщил агентству «Башинформ» Владимир Рева.

Как стало известно со страницы родственника пострадавших Кирилла Шишова, со стороны Магнитогорска волонтеры из «Легион Спаса» выдвигаются на помощь.

«Надеемся на снегоходы, чтобы при плохом раскладе доставлять воду и еду», — сообщил Кирилл.

Известно также, что на помощь выдвинулись сотрудники администрации Абзелиловского района и Абзелиловского ДРСУ, чтобы сопроводить до более безопасного места.

Как ранее сообщал «Башинформ», в Башкирии ввели временное ограничение движения для всех видов транспорта на четырех участках автодорог общего пользования. Закрыто движение на автодороге Магнитогорск — Ира на участке с 84 по 89 км и 97-156 километр.

Также полностью ограничено движение на дороге межмуниципального значения Серменево — Амангильдино — Баймак от 101 до 183 км, Сибай — Акъяр, Сибай – Халилово.

По сообщению главы администрации Сибая, выезд из города закрыт с 18 часов вечера. Он попросил не выезжать на дороги без острой необходимости.

Туры в Hotel Евразия (оз. Банное) 3* Магнитогорск Россия

Согласие на обработку персональных данных

Настоящим Я, являясь Заказчиком туристских услуг, входящих в состав туристского продукта, и уполномоченным представителем лиц (туристов), указанных в Заявке, даю согласие Агенту и его уполномоченным представителям на обработку моих данных и данных лиц (туристов), содержащихся в Заявки: фамилия, имя, отчество, дата и место рождения, пол, гражданство, серия, номер паспорта, иные паспортные данные, указанные в паспорте; адрес проживания и регистрации; домашний и мобильный телефон; адрес электронной почты; а также любых иных данных, относящихся к моей личности и личности лиц, указанных в Заявке, в объёме необходимом для реализации и предоставления туристских услуг, в том числе входящих в состав туристского продукта, сформированного Туроператором, на любое действие (операцию) или совокупность действий (операций), совершаемых с моими персональными данными и данными лиц указанных в Заявке, включая (без ограничений) сбор, запись, систематизацию, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передачу (распространение, предоставление, доступ), обезличивание, блокирование, удаление, уничтожение персональных данных, а также осуществление любых других действий, предусмотренных действующим законодательством Российской Федерации, с использованием средств автоматизации, в том числе в информационно-телекоммуникационных сетях, или без использования таких средств, если обработка персональных данных без использования таких средств соответствует характеру действий (операций), совершаемых с персональными данными с использованием средств автоматизации, то есть позволяет осуществлять в соответствии с заданным алгоритмом поиск персональных данных, зафиксированных на материальном носителе и содержащихся в картотеках или иных систематизированных собраниях персональных данных, и/или доступ к таким персональным данным, а также на передачу (в том числе трансграничную) этих персональных данных Туроператору и третьим лицам – партнерам Агента и Туроператора.

Обработка персональных данных осуществляется Агентом и его уполномоченными представителями (Туроператором и непосредственными исполнителями услуг) в целях исполнения настоящего договора (в том числе, в зависимости от условий договора – в целях оформления проездных документов, бронирования номеров в средствах размещения и у перевозчиков, передачи данных в консульство иностранного государства, разрешения претензионных вопросов при их возникновении, представления информации уполномоченным государственным органам (в том числе по запросу судов и органов внутренних дел)).

Настоящим Я подтверждаю, что переданные мной Агенту персональные данные являются достоверными и могут обрабатываться Агентом и его уполномоченными представителями.

Настоящим Я даю свое согласие Агенту и Туроператору направлять мне электронные письма/информационные сообщения на указанный мной адрес электронной почты и/или номер мобильного телефона.

Настоящим Я подтверждаю наличие у меня полномочий на предоставление персональных данных лиц, указанных в Заявке, и принимаю на себя обязательство возместить Агенту любые расходы, связанные с отсутствием у меня соответствующих полномочий, в том числе убытки, связанные с санкциями проверяющих органов.

Я согласен (на) с тем, что текст данного мной по собственной воле, в моих интересах и в интересах лиц, указанных в Заявке, согласия на обработку персональных данных хранится в электронном виде в базе данных и/или на бумажном носителе и подтверждает факт согласия на обработку и передачу персональных данных в соответствии с вышеизложенными положениями и беру на себя ответственность за достоверность предоставления персональных данных.

Настоящее согласие дается на неопределенный срок и может быть в любой момент отозвано мной, а в части качающейся конкретного лица, субъекта персональных данных, указанного в Заявке, указанным лицом, путем направления письменного уведомления в адрес Агента по почте.

Настоящим Я подтверждаю, что мои права, как субъекта персональных данных, мне разъяснены Агентом и мне понятны.

Настоящим Я подтверждаю, что последствия отзыва настоящего согласия мне разъяснены Агентом и мне понятны.

Настоящее Согласие является приложением настоящей Заявке.

отзывы туристов, фото и цены на Глэмпинг.рф

  • Минимум ночей: 1
  • Вместимость: 2 гостя
Подойдет для :
  • Молодожены
  • Пары
  • Романтики
  • Семьи
  • Сафари-Тенты: 4 шт.
  • Эко-дома: 5 шт.

Лесное пространство на берегу озера для приятного отдыха на природе! ЭКО-отдых в 40 км от Санкт-Петербурга: гриль-домики, глэмпинг, баня, питомник хаски, организация корпоративных мероприятий, свадеб, детских праздников и других памятных событий.

  • Ванная и туалет
  • Душ на территории
  • Полотенца
  • Туалет на территории
  • Спальня
  • Двуспальная кровать
  • Обогреватель
  • Постельные принадлежности
  • Кухня
  • Кухонные принадлежности
  • Обеденный стол
  • Плита
  • Посуда
  • Электрочайник
  • Территория
  • Баня
  • Гамаки и качели
  • Костровая зона
  • Мангал
  • Парковка
  • Терраса
  • Правила заезда
  • Выезд: до 12:00
  • Заезд: с 15:00
  • Правила отмены брони
  • за 15 дней: бесплатно
  • за 7 дней: без возврата
  • за 7 дней: возврат 50%
  • Запрещено
  • Вечеринки
  • Курение
  www.parklesok.ru

Месторасположение

Гостиница Эдельвейс Абзаково-Банное — горнолыжный отдых в России, туры, цены, отзывы про Гостиница Эдельвейс

Узнайте специальные цены на проживание в Гостиница Эдельвейс на сезон 2016

Уважаемые посетители, Городская Служба Бронирования благодарит Вас за интерес к нашему сайту. Обращаем Ваше внимание на то, что большинство популярных объектов размещения на Черноморском побережье раскупаются туристами уже в марте-апреле-мае. Мы искренне советуем позаботиться о своем отдыхе заранее, пока есть места и цены ниже, чем будут в пик сезона. Звоните (495)788-91-28.
Удачного Вам отдыха!

Горнолыжный отель «Эдельвейс» находится в живописном уголке Южного Урала. Уникальная природа, целебный горный воздух Башкирии, берёзовые и сосновые леса, все это ждет Вас. Расположившись в отеле, Вы имеете уникальную возможность посетить в один день 3 горнолыжных центра (считающихся лучшими на Южном Урале): «Абзаково», расположенный в 5 мин. езды (900 м), «Металлург» на озере Банное, расположенный в 20 мин. езды, «Мраткино» г. Белорецк, расположенный в 40 мин. езды.

Рядом развитая инфраструктура ДО «Абзаково». На территории находится единственный в поселке круглосуточный магазин, банкомат «Сбербанк». Гостиница открылась в 2007 году, количество мест — 60. Отель находится в 60 км. от Магнитогорска, в 25 км. от Белорецка.

Территория отеля имеет площадь 0,4 га, огороженная, охраняемая. На территории: 4 двухэтажных корпуса, столовая, кафе, караоке, фильмотека, сауна с бассейном, комната отдыха, 2 бани, продуктовый магазин, охраняемая автостоянка, банкомат Сбербанка, детская площадка, настольный теннис.

Услуги

  • заказ авиабилетов
  • заказ такси
  • заказ ж/д билетов
  • трансфер
  • Wi-Fi, интернет
  • прокат игр (нарды, шашки, шахматы)
  • междугородняя и международная телефонная связь
  • прокат бытового инвентаря
  • организация экскурсий
  • DVD-прокат
  • конференц-зал на 60 человек
  • бизнес-центр
  • Адрес

    с. Новоабзаково, пр. Горный, 4

    Как добраться
  • Поездом: № 094У — фирменный Москва-Магнитогорск, отправляется из Москвы (Казанский вокзал) по нечетным дням, время отправления 19:08, прибытие на станцию Новоабзаково 03:33 (время в пути 32:25), прибытие в Магнитогорск 04:45 (время в пути 33:37)
  • № 093У — фирменный Магнитогорск-Москва отправляется из Магнитогорска по нечетным дням, время отправления 20:00, прибытие на станцию Новоабзаково 21:06 (время в пути 106), прибытие в Москву (Казанский вокзал) 05:23 (время в пути 33:37)
  • № 676Й — пассажирский Сибай-Уфа, ежедневно, отправляется из Магнитогорска в 17:50, прибытие на станцию Новоабзаково 19:06 (время в пути 111)
  • № 675Й — пассажирский Уфа-Сибай, ежедневно, отправляется из Уфы в 21:00, прибытие на станцию Новоабзаково 05:37 (время в пути 837)
    С железнодорожного вокзала каждые 30 минут до станции Новоабзаково ходят маршрутные такси
  • Личным автотранспортом: По трассе УФА-МАГНИТОГОРСК доезжаете до станции Новоабзаково, напротив здания станции повернуть по указателю «Горнолыжный комплекс», через 150 м находится отель.
  • Отзывы о Эдельвейс, Абзаково-Банное

    Игорь, 22.07.2015 15:48:19

    Ужаснейший отель, персонал состоит из одних необразованных, неквалифицированных хамов, которым не важна их работа. Ничего не работает и винят потом вас же

    Дмитрий, 26.04.2012 16:51:52

    Вы че гоните? сто раз отдыхали в эдельвейс все круто!

    Анастасия, 02.01.2012 12:24:43

    Поехали мы в Эдельвейс ,решили заказать аппортаменты ( 2 х уровневый номер)заплатили 6000 руб,думали отдохнем по полной,и вот итог ужастный номер ,зловонный запах из раковины, грязная посуда ,все было обшарпанное,стены обшиты дешевыми пластиковыми панелями,и это по вашему вип номер????ужас какойто ,никогда больше туда не поеду в жизни и другим не советую,это не стоит таких денег,((((((((

    Николай, 13.03.2011 12:48:04

    Ходили в сауну этого отеля с 7.03.11 на 8.03.11-впечатления отвратительные!В бассейне-ледяная вода, душевые настроить практически нереально-добиться теплой воды не удалось. В комнате отдыха отвратный запах (похож на запах плесени), сама сауна холодная (темепераура не поднималась выше 70 градусов!).Телевизор плохо работает, качество изображения удручающее!И всё это за 1500 р. в час! Ушли оттуда раньше времени. Единственный плюс это приветливый персонал!

    Анастасия, 27.02.2014 15:10:58

    Жили в доме на горнолыжной, 17 (дом на 20 человек). Выделили нам только первый этаж. Абсолютно некомфортное жилье. Вода из крана преимущественно ледяная, в доме не открываются окна (жили в духоте и жаре), не работали светильники (по вечерам не хватало света), очень мало розеток. Грязная и дырявая посуда. Нет шкафов, куда можно было бы сложить вещи. По телевизору не показывают ни одного русского канала. Прям перед нашим приездом заложили бетонными блоками камин (а мы на него очень рассчитывали). Мебель старая и разваливающаяся. Двери в туалетах и душе взбухшие от влаги. Неприятный отдых.

    Посмотреть все отзывы об Эдельвейс, Абзаково-Банное→

    Туры в отель ВЕРТИКАЛЬ ГК

    Информация об отеле.

    Построен в 2010.

    Описание

    Гостиница «Вертикаль» расположена в популярном курортном месте Абзаково. Работает гостиничный комплекс круглосуточно. Комплекс представлен сразу двумя корпусами, общее количество номеров – 16. В трехэтажном корпусе «Стандарт» находится 12 номеров (общий тамбур на два номера). Также имеется четыре двухэтажных номера класса «люкс», каждый из них имеет по две комнаты. Общее количество мест в отеле – 40. На третьем этаже корпуса «Стандарт» располагается банкетный зал вместимостью до 30 человек. На территории гостиничного комплекса имеется три зоны мангалов, где отдыхающие могут самостоятельно приготовить шашлык. Гостиничный комплекс был построен в 2010 году.

    Питание в стоимость, приобретаемой туристом, путевки не входит. Постояльцы могут самостоятельно приготовить пищу в номере, для этого здесь оборудована специальная кухонная зона, которая включает электрический чайник, СВЧ-печь, холодильник и кухонную посуду. Рядом с отелем располагается кафе, ресторан и бар.

    Гостиница предлагает туристам банный комплекс, услуги которого предоставляются за отдельную плату. Функционирует крытый бассейн (5 на 8 метров), вода пресная, стоимость пользования бассейном входит в стоимость путевки. Для личного автотранспорта туристов работает открытая круглосуточно охраняемая парковка.

    На территории гостиничного комплекса созданы все условия для активного отдыха туристов: функционирует волейбольная, футбольная площадка, имеется площадка для игры в бадминтон. В зимний период работает каток. Спортинвентарь можно арендовать прямо здесь.

    Дети в возрасте до семи лет, без предоставления им отдельного места, селятся в отеле бесплатно. Для детей гостиница «Вертикаль» предлагает детский бассейн и специально оборудованную игровую площадку. Для самых маленьких отдыхающих у администрации отеля можно арендовать детские кроватки.

    Зимой большой популярностью пользуется горнолыжный курорт Абзаково, который находится всего в нескольких километрах от гостиничного комплекса. Работает экскурсионное бюро, которое предлагает самые разнообразные экскурсии по основным достопримечательностям близлежащих окрестностей.

    Гостиница располагается всего в 60 километрах от крупного города Магнитогорск. По договоренности с администрацией можно заказать трансфер с аэропорта или железнодорожного вокзала Магнитогорска.

    Расположение

    • Республика Башкортостан, Белорецкий р-он, ст. Новоабзаково, ул. Горнолыжная д.29/2
    • От г.Магнитогорска на маршрутке (каждые 15 минут) до ст.Ново-абзаково. Далее пешком или на такси. Поездом до станции Ново-Абзаково.
    • до ж/д во

      Инфраструктура

      • Бассейны
      • Бани и сауны
      • Библиотека
      • Терминал по приему оплат
      • Парковка

      Типы номеров

      • Стандарт 2-местный:
        Площадь (кв. м): 18 м?.
        Кол-во основных мест: 2.
        Кол-во доп. мест: 1.
        Мебель: две односпальные кровати/одна двуспальная кровать, прикроватная тумбочка, шкаф, стол, стулья, вешалка, зеркало, кухонная мебель.
        Оборудование: телевизор, DVD, холодильник, электрочайник, микроволновая печь, электрическая плита, набор посуды.
        Санузел: фен, с душем (поддон).
        Сервис: Wi-Fi, уборка номера, смена постельного белья, смена полотенец.
      • Люкс 4-местный 2-комнатный:
        Площадь (кв. м): 40 м?.
        Кол-во основных мест: 4.
        Кол-во доп. мест: 2.
        Мебель: двуспальная кровать, прикроватные тумбочки, раскладной диван, кресло-кровать, шкаф, журнальный столик, кресла.
        Оборудование: телевизор, холодильник, электрочайник, набор посуды, микроволновая печь, электрическая плита.
        Санузел: с душевой кабиной, фен.
        Сервис: Wi-Fi, уборка номера, смена постельного белья, смена полотенец.
        Мини-кухня.
      • Полулюкс 4-местный:
        Кол-во основных мест: 4.
        Кол-во доп. мест: 2.
        Мебель: двуспальная кровать, прикроватные тумбочки, раскладной диван, кресло-кровать, шкаф, стол.
        Оборудование: телевизор, DVD, холодильник, электрочайник, набор посуды, электрическая плита.
        Санузел: с душем, фен.
        Сервис: Wi-Fi, уборка номера, смена постельного белья, смена полотенец.
        Мини-кухня.

      Услуги

      • на стойке регистрации: утреннее пробуждение по телефону.
      • платежные системы (оплата картами): .
      • интернет: Wi-Fi на территории.
      • прокат: бытового инвентаря.
      • открытые площадки: волейбольная, футбольное поле, для бадминтона, каток.
      • дополнительно: настольный теннис.
      • прокат: спортинвентаря, коньков.

      Бесплатные услуги

      проживание, охраняемая парковка, wi-Fi на территории и в номерах

      Платные услуги

      баня, мангалы и мангальные зоны, другие дополнительные услуги

      Развлечения

      Развлечения и спорт: на территории ОСК «Абзаково» и ГЛЦ «Металлург — Магнитогорск» (Банное).

      Услуги для детей

      • Бесплатно без предоставления места и питания принимаются дети до: 7лет
      • Дети принимаются с 0
      • Инфраструктура для детей: игровая площадка, детский бассейн.

      Питание

      без питания:

      Отель на карте:

    Скидки, Отдых на озере Банное , купоны от Biglion в Уфе

    Специальное предложение для пользователей Biglion от отеля «Маяк»


    Отель «Маяк» расположен в лучшей курортной зоне Башкирии, на берегу озера Банное (с. Якты Куль), в окружении живописнейших гор и лесов.

    Отель «Маяк», без сомнения, один из самых комфортабельных на Южном Урале. Здесь вы можете отдохнуть уединенно или дружной компанией, либо устроить себе незабываемый семейный отдых.

    Отель оснащен автономным тепло- и водоснабжением, собственной скважиной с уникальным кальциево-магниевым составом воды.

    В любое время года вы сможете отвлечься от городской суеты и насладится великолепными пейзажами, покоем и тишиной. Озеро Банное (с. Якты Куль), на берегу которого находится отель, — самое глубокое в Башкирии (до 40 м), с чистейшей водой. Любителям активного отдыха безусловно придутся по душе конные прогулки по лесным и горным тропам, рыбалка на озере. Добавит адреналина игра в пейнтбол и упражнения в стрельбе.

    В зимнее время отдых в «Маяке» — это прекрасная возможность для любителей горных лыж и сноуборда испытать свои силы и получить ни с чем не сравнимое наслаждение на лучших горнолыжных трассах Урала и Сибири. Отель находится в непосредственной близости от хорошо известных горнолыжных центров: ГЛЦ «Металлург-Магнитогорск» (3,5 км) и ГЛЦ «Абзаково» (25 км), что гарантирует великолепный зимний отдых любителям горнолыжных туров.

    В общей сложности 18 трасс различной степени сложности позволят испытать незабываемое удовольствие как профессионалам, так и только начинающим осваивать горные лыжи и сноуборд. Система искусственного оснежения позволяет поддерживать трассы в отличном состоянии при температурных колебаниях или недостаточном снежном покрове с ноября по май.

    Немало удовольствия доставит любителям водных развлечений аквапарк «Аквариум» (с. Абзаково).

    Местоположение отеля гарантирует прекрасный отдых в любое время года.

    Персонал отеля готов помочь вам организовать как индивидуальный, так и корпоративный отдых. На территории отеля находится корпус с комфортабельными номерами (12 номеров) с завораживающим видом на озеро, а также 2 комплекса уютных бунгало. Все номера оборудованы по европейским стандартам, в каждом номере интернет (выделенная линия) и Wi-Fi-интернет.

    На территории отеля «Маяк» 3 бани, где гости без суеты и спешки могут по-настоящему попариться с веником, расслабиться и отведать ароматный, лечебный чай из башкирского разнотравья с медом! В отеле «Маяк» находится ресторан, который готов встречать гостей круглосуточно.

    Waunakee vs Bay Port

    Waunakee vs Bay Port

    Воунаки против Бэй-Порта

     
    Воунаки - Бэй Порт (Финал) Чемпионат WIAA по футболу среди девочек-2008 Воунаки против Бэй-Порта (6 июня 2008 г., Милуоки, Висконсин)


    Soccer Box Счет

     
    Счет футбольной коробки (финал) Чемпионат WIAA по футболу среди девочек-2008 Воунаки против Бэй-Порта (6 июня 2008 г., Милуоки, штат Висконсин.) Воунаки (23-2-1) против голов по 1-му периоду 2 Всего Bay Port (19-2-4) ------------------------------- Дата: 06.06.08 Присутствуют: Воунаки ............ 3 1 - 4 Погода: солнечно, ветрено, порт Теплого залива ............ 0 0 - 0 Порт Уонаки-Бэй Поз. ## Игрок Ш СОГ Г А Поз.## Игрок Ш СОГ Г А ------------------------------------------ -------- ---------------------------------- ВЛ 7 Челси Или ........ - - - - ВР 21 Дженна Фелпс ........ - - - - 2 Мелани Мейер ....... 2 2 - - 4 Тори Адамс .......... - - - - 4 Сара Гугель ......... 2 2 1 - 9 Кара Дели .......... 1 1 - - 5 Дженнифер Дейли ... 2 1 - - 11 Мел Патц ............ - - - - 6 Кара Дахмен......... 1 1 - - 12 Лана Банноу ......... 2 1 - - 8 Хиллари Уилсон ...... - - - 1 14 Кейтлин Гленденнинг. 1 1 - - 9 Симран Брар ......... - - - - 15 Пейдж Легат ........ - - - - 11 Сара Ниеми ......... - - - - 17 Кармен Фиорделлиси .. 1 - - - 14 Эмма Грумке ......... - - - - 18 Кэти Фарр .......... - - - - 15 Тейор Мэдиган ....... 3 2 2 - 20 Карли Фальк.......... 1 1 - - 21 Шайла Гилбертсон .... 1 - - - 23 Сэм Герчак ......... - - - - ---------- Заменители ---------- ---------- Заменители ---------- 00 Ханна Уилсон ....... - - - - 2 Лиз Фрейзер .......... - - - - 10 Сара Эндрес ........ - - - - 5 Тейлор Бейкер ........ 1 - - - 12 Джессика Хофбауэр .... 2 2 1 - 8 Келси Натолс ...... - - - - 13 Кензи Амато........ - - - - 22 Эрика Шон ........ - - - - 16 Люси Кент-Бракен ... 2 2 - - 17 Сара Одден ......... - - - - Всего .............. 7 4 0 0 18 Алисса Ларсон ....... 1 - - - 19 Дженна Гилмор ....... - - - - 20 Фиби Херман ....... - - - - 22 Шеннон Грин ....... - - - - 23 Бетани Аннен ....... - - - - Итоги.............. 16 12 4 1 Порт Уонаки-Бэй ## МИН. Сохраненное время игрока ## МИН. Сохраненное время игрока --------------------------------------- ----------- ---------------------------- 7 Челси Эли ........ 75:41 0 4 21 Дженна Фелпс ........ 80:00 4 8 21 Шайла Гилбертсон .... 0:00 0 0 00 Ханна Уилсон ....... 4:19 0 0 Броски по периодам 1 2 Всего Сейвов по периодам 1 2 Всего ------------------------------- ------------------- ------------ Воунаки............ 9 7 - 16 Воунаки ............ 2 2 - 4 Bay Port ............ 2 5-7 Bay Port ............ 4 4-8 Угловые удары 1 2 Tot Фолы 1 2 Tot ------------------------------- ------------------- ------------ Воунаки ............ 4 1 - 5 Воунаки ............ 4 5 - 9 Бухта порта ............ 0 0 - 0 Бухта порта............ 3 4 - 7 РЕЗЮМЕ ОЦЕНКИ: Время на голы Команда ## Голы, забившие голы, голевые передачи -------------------------------------------------- --------------------------------------- 1. 20:49 П 15 Тейор Мэдиган 8 Хиллари Уилсон 2. 22:02 З 4 Сара Гугель Штрафной удар 3. 34:51 Вт 15 Тайор Мэдиган Без посторонней помощи 4. 75:41 Вт 12 Джессика Хофбауэр Без посторонней помощи ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЯ И ВЫБРОСЫ: Судьи: Судья: Джей Коберт; Асс.Судья: Билл Рич; Сретен Павлович; РАЗДЕЛ 1 ПОЛУФИНАЛ: Воунаки переходит в титульную игру. в своем первом государственном появлении в субботу против Divine Спаситель Святые Ангелы в 14:00. Bay Port исключен из первое государственное появление. ___________________________ Подпись судьи

    Обзор футбольного матча

     
    Обзор футбольного матча (финал) Чемпионат WIAA по футболу среди девочек-2008 Воунаки против Бэй-Порта (6 июня 2008 г., Милуоки, штат Висконсин.) Воунаки (23-2-1) против Бэй-Порта (19-2-4) Дата: 06.06.08 Посещаемость: Погода: солнечная, свежая, теплая Голы по периоду 1 2 Всего ------------------------------- Воунаки ............ 3 1 - 4 Бухта Порт ............ 0 0 - 0 РЕЗЮМЕ ОЦЕНКИ: 1. 20:49 Тэйор Мэдиган (Хиллари Уилсон) 2. 22:02 Вт Сара Гугель (Пенальти) 3. 34:51 Вт Тайор Мэдиган (без посторонней помощи) 4. 75:41 Вт Джессика Хофбауэр (без посторонней помощи) Выстрелы: Waunakee 16, Bay Port 7 Сейвы: Воунаки 4 (Челси Эли 4), Бэй Порт 8 (Дженна Фелпс 8) РАЗДЕЛ 1 ПОЛУФИНАЛ: Воунаки переходит в титульную игру. в своем первом государственном появлении в субботу против Divine Спаситель Святые Ангелы на 2 р.м. Bay Port исключен из первое государственное появление.

    Науки о Земле | Бесплатный полнотекстовый | Газлифтный механизм с использованием CO2 в круговороте гейзера (кальдера Узон, Камчатка)

    На Рисунке 3 мы показываем изменение во времени среднего значения IBE этого нового гейзера в период 2012–2019 гг. Среднее значение IBE за август 2012 г. — май 2017 г. было довольно стабильным в диапазоне от 129 до 144 минут, но в 2018 году среднее значение IBE упало до 88 минут, а затем до 80 минут в августе 2019 года. Химическая история гейзера Шаман показала, что значительное разбавление с течением времени основных компонентов (Cl, Na, K, Ca и H 3 BO 3 уменьшилось в ~ 3 раза), pH снизился с 6.От 4 до 4,6; тем не менее, SO 4 остается достаточно стабильным (табл. 1). Наблюдается тенденция снижения стабильных изотопов воды (δD ‰, δ 18 O) в период 2015–2018 гг. Состав газа был относительно стабильным с преобладанием CO 2 (в среднем 80% об.) (Таблица 2), что привело к снижению температуры кипения в бассейне гейзера до 82,7 ° C (Рисунок A4 в Приложении A). Стоит отметить четкие сигнатуры δ 13 C ‰ магматического CO 2 (изменяется от −6.От 8 ‰ до −3,4 ‰) и абиотико-термогенного CH 4 (изменяется от −30,4 ‰ до −22,9 ‰) [17] в газовых компонентах гейзера Шаман (табл. 2) и N 2 / Ar соотношение (от 50 до 492) также превышает коэффициент насыщенности атмосферной воды, что указывает на внеатмосферное происхождение некоторого N 2 . Увеличение NH 4 24.08.2019 могло быть вызвано растворением NH 3 , образовавшегося в результате реакции N 2 + 3H 2 → 2NH 3 , если образование H 2 в магме –Гидротермальная система в это время увеличилась.Пробы газа, взятые как у Шамана, так и у Шамана-2 02.05.2018 г., а также пробы из Шамана-2 27.08.2019, сильно загрязнены воздухом. Одновременно изменились поверхностные гидрологические условия: колебания температуры воды в ручье, подпитываемой источником Sh4, и таяние дождя / снега (Рисунок 2, Рисунок A3 в Приложении A) частично изменили направление (Рисунок A6 в Приложении A) их воды. течет в бассейн Шамана, вызванный оседанием области бассейна (Рисунок A6 в Приложении A). Водовод гейзера Шаман также значительно расширился в то время (Рисунок А5 в Приложении А).Стили извержений гейзера Шаман в 2014 и 2019 годах также показаны на Рисунке A7 и Рисунке A8 в Приложении A. В апреле 2019 года стиль извержения гейзера Шаман изменился по сравнению с обычными стилями циклического движения, наблюдавшимися ранее (соответствует ряду вертикальных изображений от 06.09.2019). 2014 и 21.04.2019). В период с 2008 по 2018 год наблюдалось одно крупное извержение, но в апреле 2019 года произошло несколько (от трех до четырех) извержений за несколько минут выброса гейзера (Рисунок A8). Затем, в июне 2019 года, извержения гейзера Шаман вообще прекратились.Когда ожидались извержения, в обычное время наблюдались только пузыри. Тем не менее, в июле 2019 года стиль цикла гейзеров (несколько стилей извержений от трех до пяти) был восстановлен, и активность гейзеров продолжилась (Рисунок A7 и Рисунок A8 (12.09.2019)).

    На снижение отложения амилоида у мышей со сверхэкспрессией RTN3 отрицательно влияют преформированные дистрофические нейриты

    Abstract

    Ретикулон 3 (RTN3) был первоначально идентифицирован как отрицательный модулятор BACE1, фермента, который расщепляет белок-предшественник амилоида (APP) с высвобождением β-амилоидного пептида.Интересно, что RTN3 также может образовывать агрегаты после накопления, и повышенная агрегация RTN3 коррелирует с образованием иммунореактивных дистрофических нейритов RTN3 (RIDN) в головном мозге пациентов с болезнью Альцгеймера. Трансгенные мыши, экспрессирующие только RTN3, развивают RIDN в своем гиппокампе, но не в коре головного мозга. Чтобы определить эффекты in vivo RTN3 и предварительно сформированных RIDN на отложение амилоида, мы скрестили битрансгенных мышей, экспрессирующих мутации APP и пресенилина 1 (PS1), с мышами, сверхэкспрессирующими RTN3.Мы обнаружили, что отложение амилоида в коре головного мозга, области CA3 гиппокампа и зубчатой ​​извилине было значительно снижено у тройных трансгенных мышей по сравнению с битрансгенными контрольными мышами. Однако уменьшение отложения амилоида в области CA1 гиппокампа, где RIDN преимущественно образовывались до отложения амилоида, было менее значительным. Следовательно, предварительно сформированные агрегаты RTN3 в RIDN явно компенсируют отрицательную модуляцию активности BACE1 с помощью RTN3. Более того, наше исследование показывает, что повышенная экспрессия RTN3 может приводить к изменению внутриклеточного трафика BACE1 за счет сохранения большего количества BACE1 в компартменте эндоплазматического ретикулума, где расщепление APP BACE1 менее благоприятно.Наши результаты предполагают, что ингибирование агрегации RTN3, вероятно, будет полезным за счет уменьшения как отложения амилоида, так и образования RIDN.

    Введение

    Нейритные бляшки, отличительный признак патологии болезни Альцгеймера (БА), относятся к отложениям β-амилоидного пептида (Aβ), окруженным активированной микроглией, реактивными астроцитами и дистрофическими нейритами (Tanzi and Bertram, 2005). Дистрофические нейриты с характерной морфологией набухших дендритов и / или аксонов распознаются антителами, специфичными к различным белкам, включая убиквитин (Kowall and Kosik, 1987; Perry et al., 1987; Onorato et al., 1989), нейрофиламент (Dickson et al., 1999) и GAP-43 (Masliah et al., 1992). Недавно мы продемонстрировали, что отдельная популяция дистрофических нейритов, маркированная антителом, специфичным к ретикулону 3 (RTN3), представляет собой более многочисленные дистрофические нейриты (Hu et al., 2007). На данном этапе пространственные и временные отношения между дистрофическими нейритами, иммунореактивными к различным антителам, остаются неясными.

    Формирование дистрофических нейритов часто рассматривается как событие после отложения амилоида, потому что трансгенные мыши, экспрессирующие семейный мутантный белок-предшественник амилоида (APP), продуцируют дистрофические нейриты, которые окружают амилоидные бляшки (Games et al., 1995; Holcomb et al., 1998). Однако обычно не обнаруживается, что дистрофические нейриты окружают отложения Aβ в диффузной форме (Joachim et al., 1989), предполагая, что одного Aβ может быть недостаточно для запуска образования различных дистрофических нейритов у человека. Сформируются ли дистрофические нейриты до отложения амилоида и повлияет ли возникновение дистрофических нейритов на формирование отложения амилоида — важные вопросы, требующие ответа. В этом исследовании мы рассмотрели эти вопросы с помощью животной модели со сверхэкспрессией RTN3.

    RTN3 является членом семейства белков ретикулонов (RTN), которые продемонстрировали неврологические функции (Oertle and Schwab, 2003; Yan et al., 2006). Мы и другие показали, что белки RTN, в частности RTN3 нейронов, взаимодействуют с BACE1 и что это взаимодействие отрицательно модулирует расщепление BACE1 APP (He et al., 2004, 2006; Murayama et al., 2006; Wojcik et al., 2007 ). Изучая роль in vivo и RTN3 в патогенезе AD, мы также обнаружили, что RTN3 обогащен RTN3 иммунореактивными дистрофическими нейритами (RIDNs) в головном мозге AD.Что еще более важно, у трансгенных мышей, сверхэкспрессирующих RTN3 (Tg-RTN3), развиваются RIDN преимущественно в их гиппокампе (Hu et al., 2007), и это коррелирует с образованием агрегатов RTN3 в восприимчивых областях мозга. Из-за этой уникальной особенности, присутствующей в этой модели на животных, мы задали два важных вопроса в этом исследовании: (1) будет ли повышенная экспрессия RTN3 уменьшать отложение амилоида посредством отрицательной модуляции активности BACE1; (2) будут ли предварительно сформированные RIDN в этой модели влиять на отложение амилоида из-за присутствия агрегации RTN3.Чтобы ответить на эти вопросы, мышей Tg-RTN3 скрещивали с трансгенными мышами, экспрессирующими шведский мутантный APP и мутантный пресенилин 1 (PS1). Образцы мозга трипгенных мышей сравнивали с родительскими бигенными мышами. Хотя сверхэкспрессия RTN3 снижает отложение амилоида в большинстве областей мозга, агрегированный RTN3 в предварительно сформированных RIDN снижает негативную модуляцию активности BACE1 с помощью RTN3. Знания, полученные в результате этого исследования, продвинули наше понимание роли in vivo RTN3 в патогенезе БА, а также влияния дистрофических нейритов на отложение амилоида.

    Материалы и методы

    Штаммы мышей, клеточные линии и биохимические реактивы.

    мышей Tg-RTN3 были получены в лаборатории, как описано ранее (Hu et al., 2007). Вкратце, мышей Tg-APPsw / PSEN1DE9 (Tg-PA) были приобретены в Jackson Laboratory (складской № 004462). Мыши Tg-RTN3; APPsw / PSEN1DE9 (Tg-R3PA) были получены путем скрещивания мышей Tg-RTN3 с мышами APPsw / PSEN1DE9. Всех мышей в исследовании содержали и использовали в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных в клинике Кливленда.Клетки HR3M представляли собой клетки, происходящие из HEK-293, которые стабильно экспрессировали меченый myc RTN3 (He et al., 2004). Клетки HM представляют собой клетки, происходящие из HEK-293, которые стабильно экспрессируют меченный HA BACE1 (Qahwash et al., 2003). Антитела против β-амилоидного пептида (6E10), калнексина (C4731), тега myc, β-актина (A5441) и конца APP C (A8717) были приобретены у Sigma-Aldrich. Антитела R454 и R458 распознавали N-конец и С-конец RTN3, соответственно, и были получены в лаборатории (He et al., 2004). Антитело против BACE1, B279 было изготовлено в лаборатории, а антитело 3d5 было щедрым подарком от Dr.Роберт Вассар (Медицинский факультет Файнберга Северо-Западного университета, Чикаго, Иллинойс). Вторичные антитела, меченные Alexa Fluor 488 и 568, были приобретены у Invitrogen. DAB (3,3 ‘диаминобензидинтетрагидрохлорид, D5905) и тиофлавин S были приобретены у Sigma-Aldrich. Элитный набор авидин-биотинового комплекса был приобретен в Vector Laboratories. Таблетка с полным ингибитором протеазы была приобретена у Roche Biosciences. Гели Bis-Tris NuPage (4–12% и 12%) и гели Tris-глицина (16%) были приобретены в Invitrogen.Набор Super Signal West Pico и наборы для биотинилирования белков клеточной поверхности были приобретены у Pierce.

    Иммуногистохимия, иммуно-конфокальная микроскопия и количественное определение.

    Иммуногистохимические и конфокальные эксперименты были выполнены в соответствии со стандартными методами, как описано ранее (He et al., 2007). Вкратце, правая половина мозга мышей Tg-R3PA и Tg-PA (возраст 180 дней) была сагиттально срезана толщиной 16 мкм с использованием криостата после фиксации 4% параформальдегидом и О.C.T. встраивание. При иммуногистохимическом окрашивании фиксированные сагиттальные срезы головного мозга первоначально реагировали с моноклональным антителом против Aβ 6E10, а затем детектировались комплексом вторичного антитела, конъюгированного с HRP, и DAB. Окрашивание тиофлавином S проводили следующим образом. После первоначальной промывки в дистиллированной воде предварительно закрепленные замороженные срезы мозга инкубировали в 0,3% Triton X-100 в PBS (1 ×) в течение 30 мин. После дополнительной промывки в воде срезы окрашивали 1% тиофлавином S в воде.Затем окрашенные срезы инкубировали в 70% этаноле в течение 5 минут, снова промывали, наносили монтажную среду Vecta Shield и исследовали с использованием флуоресцентной микроскопии Leica и программного обеспечения Magna FIRE. Для исследования бляшек Aβ иммуномечено 16 сагиттальных срезов головного мозга (расстояние 160 мкм) на мышь. Отложение Aβ детектировали с помощью первичного антитела 6E10 (разведение 1: 1000) и вторичного антитела против IgG мыши, конъюгированного с Alexa Fluor 568 (разведение 1: 2000). Как клеточные RTN3, так и RIDN были обнаружены с помощью первичного антитела R458 (разведение 1: 1000) и вторичного антитела против кроличьего IgG, конъюгированного с Alexa Fluor 488 (разведение 1: 1000).Изображения были изучены и сняты с помощью конфокального микроскопа Leica. Для Alexa Fluor 568 использовался лазер 581 нм, и сигналы флуоресценции отображались в красном канале, тогда как лазер 488 нм использовался для Alexa Fluor 488, а результаты визуализировались в зеленом канале.

    Количественная оценка β-амилоидных бляшек была проведена на изображениях, полученных из сагиттальных срезов головного мозга, окрашенных антителом 6E10 либо иммуногистохимическим, либо иммуноконфокальным окрашиванием (Borchelt et al., 1997). Срезы головного мозга каждой мыши были визуализированы, а площади и плотность бляшек были измерены с помощью программного обеспечения NIH ImageJ.Общее количество нейритных бляшек Aβ в 16 срезах головного мозга мыши было определено беспристрастным образом (Dong et al., 2004). Групповые средние числа бляшек рассчитывали на основе суммы подсчетов от отдельных животных в каждой группе. Площадь β-амилоидных бляшек (нагрузка на бляшки) была определена, и изображения были сняты с помощью конфокального микроскопа Leica (объектив 20 ×) и количественно оценены с помощью программного обеспечения NIH ImageJ в виде процента от общей площади коры головного мозга, площади гиппокампа или субгиппокампа от восьми. секции в каждом животном.Был установлен пороговый уровень интенсивности для различения иммунореактивности бляшек и фонового мечения. Порог обнаружения оставался постоянным на протяжении всей количественной оценки изображения. Сосудистые сигналы были исключены из анализа.

    Статистический анализ был выполнен с использованием GraphPad Prism. Односторонний критерий Стьюдента t был использован для расчета статистической значимости между двумя группами данных. Односторонний дисперсионный анализ выполнялся, когда статистический анализ затрагивал три или более групп. F Тестирование выполняется автоматически программным обеспечением.

    Количественное определение пептидов Aβ с помощью ELISA.

    Нерастворимые Aβ 1–40 и Aβ 1–42 были экстрагированы из агрегированных Aβ 1–40 и Aβ 1–42 в тканях мозга с помощью метода гидрохлорида гуанидина (Wang et al., 2006 ). Уровни Aβ 1–40 и Aβ 1–42 в левой коре головного мозга и гиппокампе анализировали отдельно с помощью сэндвич-ELISA в соответствии с лабораторными стандартами, как описано ранее (Yan et al., 1999).

    Вестерн-блоттинг белков мозга.

    Замороженные иссеченные ткани мозга мыши использовали для вестерн-блоттинга. Ткани головного мозга гомогенизировали в 1% CHAPS, растворенном в (1 ×) растворе PBS, полных ингибиторах протеаз Roche (1 ×) и 0,1 мМ ингибиторе фосфатазы Na 3 VO 4 на льду. Суммарные белки экстрагировали из гомогенатов вращением на ротаторе в течение 30 мин при 4 ° C. После центрифугирования при 15000 × g в течение 120 мин супернатанты собирали.Общие концентрации белка в супернатантах определяли с помощью реагента для анализа белка BCA (Pierce). Равные количества супернатанта (40 мкг общего белка) разделяли на 4–12% гелях Bis – Tris NuPage с последующим стандартным вестерн-блоттингом с указанными антителами. Хемилюминесцентные сигналы для белков на Вестерн-блоттинге сканировали, и их интегральные значения плотности рассчитывали с помощью системы хемилюминесцентной визуализации (Alpha Innotech).

    Субклеточное фракционирование.

    Клеточные линии HR3M и HEK293 сначала выращивали в среде DMEM в течение 24 часов в 10-миллиметровых планшетах до ~ 70% слияния, а затем клетки трансфицировали плазмидной ДНК, экспрессирующей BACE1, в течение 24 часов с использованием реагента для трансфекции липофектамина в соответствии с инструкциями производителя. .Трансфицированные клетки подвергали субклеточному фракционированию в градиенте сахарозы в соответствии с процедурами, описанными ранее (Yan et al., 2001) . Градиенты центрифугировали при 22000 об / мин в течение 18 ч при 4 ° C в роторе Beckman SW41Ti. Фракции (12 × 1 мл) собирали с вершины градиента, и распределение BACE1, RTN3 и APP по градиенту анализировали с помощью вестерн-блоттинга. Антитела B279, C-концевой APP и R458 использовали для обнаружения BACE1, APP и RTN3 соответственно.Антитела против калнексина, β-COP, TGN38 и EEA1 использовали для обозначения компартментов эндоплазматического ретикулума (ER), Гольджи и ранних эндосом соответственно. Альтернативно, клетки HM трансфицировали либо пустым вектором, либо RTN3, и субклеточные компартменты трансфицированных клеток фракционировали в градиенте йодиксанола в соответствии с опубликованными процедурами (Xia et al., 1998).

    Биотинилирование белков клеточной поверхности.

    Обнаружение RTN3 на поверхности клеток проводили в двух различных экспериментальных условиях.Сначала плазмидный вектор экспрессии BACE1 был временно трансфицирован как в клетки HEK-293, так и в клетки HR3M для усиления обнаружения BACE1 из-за существующей низкой чувствительности обнаружения антитела BACE1. После 24-часовой трансфекции белки клеточной поверхности биотинилировали путем инкубации живых трансфицированных клеток с 0,25 мг / мл EZ-Link Sulfo-NHS-SS-биотином при 22 ° C, как описано ранее (Yan et al., 2001). Вкратце, после гашения и промывки биотинилированные клетки лизировали в буфере для лизиса (20 мМ HEPES при pH 7.9, 10 мм KCl, 1 мм EDTA, 1 мм EGTA, 1% Nonidet NP-40, 10% глицерин и ингибиторы протеаз) при 4 ° C в течение 30 минут на ротаторе и центрифугировании в течение 5 минут при 15000 × g . Супернатанты собирали как общие белки. Части всех белков использовали в эксперименте по нейтравидину для выделения биотинилированных поверхностных белков. Затем все белки и поверхностные белки разделяли на 12% гелях Bis-Tris NuPage и анализировали вестерн-блоттингом. Во втором эксперименте клетки НМ, экспрессирующие ВАСЕ1, трансфицировали 10 мкг либо пустой векторной ДНК, либо векторной ДНК, экспрессирующей RTN3, в течение 48 часов.Эксперименты по биотинилированию и вытеснению проводили в соответствии с теми же процедурами, описанными выше. Вестерн-блоттинг выполняли, как описано выше.

    Результаты

    Измененный процессинг APP у трансгенных мышей RTN3

    Мы ранее показали, что избыточная экспрессия RTN3 увеличивает его взаимодействие с BACE1, тем самым изолируя BACE1 для расщепления его субстрата APP (He et al., 2004). Это открытие привело нас к гипотезе, что RTN3 играет роль в AD посредством подавления продукции Aβ и уменьшения отложения амилоида in vivo .Чтобы проверить нашу гипотезу, мы сначала создали трансгенных мышей со сверхэкспрессией RTN3, управляемой промотором прионного гена мыши. Как описано недавно (Hu et al., 2007), среди трех линий генерированных мышей Tg-RTN3, мыши линии 3 (L3) экспрессируют самые высокие уровни трансгена RTN3. Вестерн-блоттинг лизатов белков этой линии мышей показал, что уровни RTN3 у мышей Tg-RTN3 были в ~ 4 раза выше, чем у мышей дикого типа (фиг. 1 A ). На уровни BACE1 не оказало заметного влияния повышенная экспрессия RTN3 у мышей этой линии (рис.1 А ). Точно так же уровни высокомолекулярных видов АРР также были сопоставимы в обоих генотипах мышей (рис. 1 A ). Однако уровни CTF99, C-концевого фрагмента APP, расщепленного BACE1, были немного снижены (фиг. 1 A ). Когда было рассчитано соотношение CTF99 к APP, было явное снижение уровней CTF99 у мышей Tg-RTN3 (0,18 ± 0,02 против 0,11 ± 0,01; n = 3, p <0,001). Когда было рассчитано соотношение CTF99 к CTF83, содержащему CTF89, это уменьшение CTF99 также было очевидным (0.14 ± 0,02 против 0,07 ± 0,01; p <0,001, n = 3). APP также расщеплялся BACE1 по β ‘сайту с образованием CTF89 (Huse et al., 2002; Tomasselli et al., 2003). Однако в некоторых условиях электрофореза CTF89 часто был неотделим от CTF83, продукта АРР, связанного с С-концевой мембраной, после расщепления α-секретазой в домене Aβ (сравните рис. 1 с дополнительным рис. 1, доступным на www.jneurosci. org в качестве дополнительного материала). Вместе эти данные показывают, что более высокие уровни in vivo RTN3 вызывают снижение расщепления АРР ВАСЕ1.Интересно, что снижение уровней CTF99 неоднократно наблюдалось только в лизатах, приготовленных из коры головного мозга мышей Tg-RTN3, и было менее очевидным в лизатах из гиппокампа (рис. 1 B ) (CTF99 / APP: 0,12 ± 0,02 дюйма). Tg-R3PA против 0,09 ± 0,01 в Tg-PA; p <0,05, n = 3). Это явление регионального неравенства будет подробнее рассмотрено ниже.

    Рисунок 1.

    Обработка APP у трансгенных мышей RTN3. A . Равные количества белковых экстрактов мышей дикого типа (WT) и трансгенных мышей, экспрессирующих кДНК RTN3 человека (Tg-RTN3), анализировали с помощью вестерн-блоттинга.Антитело R458 распознает С-конец RTN3, и более высокие уровни RTN3 были обнаружены в образцах Tg-RTN3. BACE1 выявляется с помощью антитела B279. Антитело A8717, специфичное к C-концу APP, использовали для обнаружения полноразмерного APP, его фрагментов CTF99 и CTF83. Антитела, распознающие калнексин, использовали для проверки равной нагрузки. Уровни белка полноразмерного APP были нормализованы к уровню калнексина, и отношения CTF99 к CTF83 или полноразмерному APP были нанесены на график, чтобы отразить сниженные уровни CTF99 в коре головного мозга Tg-RTN3.Эти результаты были обобщены из трех независимых экспериментов и продемонстрировали, что у мышей Tg-RTN3 отношение CTF99 к CTF83 было снижено ( p <0,001), как и отношение CTF99 к APP ( p <0,001). Однако оказалось, что разница в уровнях APP между WT и Tg-RTN3 очень мала. B , Лизаты белков из гиппокампа были проанализированы таким же образом, как и в коре головного мозга ( A ), но снижение уровней CTF99 в образцах гиппокампа Tg-RTN3 было менее значительным по сравнению с WT. контролирует.

    Экспрессия трансгенного RTN3 по-разному влияла на отложение Aβ в головном мозге и гиппокампе

    Поскольку отложения амилоида никогда не формировались у мышей, экспрессирующих только эндогенный APP, мы скрестили мышей Tg-RTN3 L3 с битрансгенными мышами Tg-APPswe / PSEN1ΔE9 (сокращенно Tg-PA-мыши) для получения тройных трансгенных мышей Tg-RTN3 / APPswe / PSEN1ΔE9. мышей (сокращенно Tg-R3PA), чтобы определить, повлияет ли повышенная экспрессия RTN3 на отложение амилоида. Мыши Tg-PA экспрессируют как семейный мутантный PS1 с делецией экзона 9, так и шведский мутантный APP под контролем прионного промотора, и эта линия мышей широко используется в качестве модели AD для репликации отложений амилоида у животных (Borchelt et al. al., 1997). Исследование тройных трансгенных мышей (Tg-R3PA) позволило нам обнаружить влияние RTN3 на продукцию Aβ и отложение амилоида по сравнению с мышами Tg-PA, у которых обычно образуются амилоидные бляшки в возрасте 6 месяцев. По достижении 6-месячного возраста (точно в 180 дней) мышей Tg-PA и Tg-R3PA умерщвляли, и их мозг собирали для биохимических и иммуногистохимических исследований, которые включали измерение уровней Aβ с помощью ELISA и количественную оценку плотности бляшек Aβ. Чтобы свести к минимуму потенциальный гендерный эффект на продукцию Aβ и отложение амилоида, в наших биохимических и иммуногистохимических исследованиях были задействованы только самки мышей.Для получения согласованности левую половину мозга мышей Tg-PA и мышей Tg-R3PA использовали для биохимических анализов, а правую половину использовали для иммуногистохимического анализа.

    При иммуногистохимическом окрашивании фиксированных сагиттальных срезов головного мозга отложений Aβ в коре головного мозга мышей Tg-R3PA, обнаруживаемых моноклональным антителом 6E10, которое специфически реагирует с N-концевой областью человеческого Aβ, было заметно меньше, чем в сопоставимой области коры Tg. -РА мыши (рис.2 A , B ).Однако уменьшение количества конденсированных отложений Aβ во всем гиппокампе мышей Tg-R3PA было менее значительным (фиг. 2 A , B ).

    Фигура 2.

    Снижение отложения Aβ в головном мозге мышей Tg-R3PA. A , B , Иммуногистохимический анализ отложений конденсированного Aβ в сагиттальных срезах мозга 6-месячных мышей Tg-PA ( A ) и Tg-R3PA ( B ) с использованием антитела 6E10.По сравнению с мышами Tg-PA, отложения конденсированного Aβ были значительно уменьшены в коре головного мозга, но снижение было менее очевидным в гиппокампе мышей Tg-R3PA по сравнению с мышами Tg-PA. Очаги нейритных бляшек количественно анализировали на основании ручного подсчета Aβ-иммунореактивных отложений в сагиттальных срезах мозга Tg-PA и Tg-R3PA под иммуноконфокальной микроскопией. Исследовали шестнадцать сагиттальных срезов (на расстоянии 140 мкм) от каждой мыши Tg-PA ( n = 4) и мыши Tg-R3PA ( n = 5).Среднее количество бляшек для каждой группы мышей выражают как количество нейритных бляшек ± SEM ( p <0,01, непарный тест t ). C , Сниженная нагрузка бляшек Aβ у мышей Tg-R3PA. Нагрузку на бляшки Aβ определяли как процент площади, занятой Aβ-иммунореактивными конденсированными отложениями, от общей исследуемой площади. Данные визуализации для нагрузки бляшек Aβ были собраны из тех же окрашенных иммунофлуоресценцией срезов, которые использовались для подсчета количества бляшек (красный канал), и проанализированы с помощью программного обеспечения ImageJ, когда был включен только красный канал ( p <0.05, непарный т тест). D – G , Сагиттальные срезы головного мозга также окрашивали соединением тиофлавин S. Агрегированные отложения Aβ в головном мозге Tg-R3PA ( E ) были значительно уменьшены по сравнению с той же площадью Tg-PA. мыши ( D ). Напротив, снижение было менее значительным в области гиппокампа мышей Tg-PA ( F ) и Tg-R3PA ( G ). ctx, кора головного мозга; гипп, гиппокамп.Масштабные линейки: A , B , 0,5 мм; (в G ) D-G , 0,2 мм.

    Количественная оценка количества бляшек Aβ в коре головного мозга и гиппокампе мышей Tg-R3PA и Tg-PA показала, что среднее количество бляшек кортикального нейрита Aβ составляло 661,2 ± 148,2 в 16 сагиттальных срезах мозга мышей Tg-R3PA (140 мкм между две секции; n = 4), что значительно ниже соответствующего числа бляшек 1605 ± 177.4 в сопоставимых срезах мышей Tg-PA ( n = 5) (снижение на 55,5%; p <0,01, непарный тест t ). Кроме того, мы также определили площадь, занимаемую компактными бляшками Aβ, используя программное обеспечение ImageJ для количественной оценки плотности бляшек Aβ или нагрузки. Наш результат показал, что 0,342 ± 0,0743% исследованной лобной коры головного мозга мышей PA было занято конденсированным отложением Aβ, тогда как только 0,124 ± 0,0567% исследованной площади мышей R3PA было занято конденсированным отложением Aβ (рис.2 C ) (уменьшено на 63,8%; p <0,05, непарный тест t ).

    Для дальнейшего подтверждения вышеизложенного наблюдения мы окрашивали бляшки Aβ другим широко используемым методом, окрашиванием тиофлавином-S, и результаты также показали меньшее количество бляшек в кортикальной области мышей Tg-R3PA, чем в соответствующей области мышей Tg-PA ( Рис. 2 D – G ). Разница в областях гиппокампа была меньше (рис. 2 F , G ), что согласуется с вышеуказанными результатами иммуногистохимического окрашивания.

    Ясно, что существует дифференциальный эффект RTN3 на отложение амилоида, согласующийся с измененными уровнями CTF99 у мышей Tg-RTN3. Насколько нам известно, этот региональный дифференциальный эффект на отложение Aβ кажется уникальным, учитывая тот факт, что экспрессия трансгена RTN3 в этих двух областях сходна. Этот дифференциальный эффект предполагает наличие дополнительных факторов в головном мозге или гиппокампе, которые привели к этому несоответствию. На основании наших наблюдений, что RIDN спонтанно продуцируются в основном в гиппокампе, но не в головном мозге мышей Tg-RTN3 (Hu et al., 2007), мы предположили, что преформирование RIDN могло вызвать это региональное несоответствие.

    Влияние предварительно сформированных RIDN на отложение Aβ

    Чтобы добавить дополнительную поддержку нашей вышеупомянутой гипотезе, мы выполнили конфокальное исследование путем двойного мечения с использованием моноклонального антитела 6E10 для обнаружения амилоидных бляшек и антитела R458, специфичного к концу RTN3-C, для обнаружения RIDN. Мы обнаружили, что большие количества диспергированных RIDN были обнаружены только в области CA1 гиппокампа Tg-R3PA, распространяясь на CA3, а некоторые также были идентифицированы в зубчатой ​​извилине (рис.3 D ). RIDN в этих областях были впервые сформированы в возрасте 3 месяцев (Shi et al., 2009). В этом возрасте в коре головного мозга было мало рассеянных RIDN (Рис. 3 A , B ), что согласуется с нашим предыдущим отчетом (Hu et al., 2007). Примечательно, что повышенная экспрессия RTN3 фактически способствует образованию RIDN в окружающих отложениях амилоида (Fig. 3 B , стрелка). В целом размер амилоидных бляшек был больше у мышей Tg-PA, чем у мышей Tg-R3PA, тогда как RIDN были более очевидными у мышей Tg-R3PA, чем у мышей Tg-PA (рис.3).

    Рисунок 3.

    Уменьшение нейритных бляшек в коре головного мозга мышей Tg-R3PA. A – D , Иммуноконфокальный анализ отложения конденсированного Aβ в гиппокампе мышей Tg-PA и Tg-R3PA в возрасте 6 месяцев с использованием антитела 6E10 против Aβ (красный) и антитела R458 против C-конца RTN3 (зеленый). По сравнению с мышами Tg-PA, мыши Tg-R3PA имели значительно меньшее количество нейритных бляшек Aβ в коре головного мозга ( A , B ), но это снижение было менее значительным в их гиппокампе ( C , D ).Примечательно, что у мышей Tg-R3PA образовывались RIDN в основном в области CA1 с небольшим распространением в области CA3 и зубчатой ​​извилины, тогда как у мышей Tg-PA не продуцировались подобные типы диспергированных RIDN. Хотя в кортикальной области мышей Tg-R3PA или Tg-PA не было обнаружено диспергированных RIDN, амилоидные бляшки в образцах Tg-R3PA были явно окружены большим количеством RIDN, как указано стрелками. E . Аналогично помеченные очаги нейритных бляшек были количественно проанализированы на основании указанных субрегионов гиппокампа Tg-PA и Tg-R3PA мозга ( p <0.05, непарный т тест). F . Количество бляшек, занятых на квадратный мм исследуемых срезов, также наносили на график, чтобы показать последовательное уменьшение амилоидных бляшек в коре Tg-R3PA, но не в области CA1. Открытая полоса представляет мышей PA, а закрытая полоса представляет мышей R3PA. Шкала: (в D ) A – D , 0,2 мм.

    Как показано на фиг. 2 C , нагрузка бляшек Aβ во всем гиппокампе существенно не различалась у мышей Tg-R3PA и Tg-PA.Так как RIDN формируются в основном в области CA1 и меньше в области CA3 и зубчатой ​​извилины, дальнейшая количественная оценка этих подобластей была выполнена. Мы обнаружили, что только количество конденсированных бляшек Aβ в области CA1 мышей Tg-R3PA (обогащенных RIDN) не было значительно снижено по сравнению с таковым у мышей Tg-PA (34,0 ± 6,26 на 16 срезов против 47,3 ± 4,67 на 16 срезов). ; p > 0,05, непарный тест t ), тогда как количество бляшек было значительно снижено в CA3 мыши Tg-R3PA (19.2 ± 5,54 против 38,0 ± 3,46 на 16 секций; снижена на 49,5%, p <0,05) и области зубчатых извилин (50,4 ± 14,2 против 90,0 ± 5,03 на 16 секций; уменьшено на 44,0%; p <0,05) (рис.3 E ). Альтернативная количественная оценка, которая измеряет количество бляшек на квадратный миллиметр исследованных образцов, также продемонстрировала согласованность этих результатов (рис. 3 F ).

    В совокупности мы показали здесь, что повышенный уровень RTN3 значительно снижает образование бляшек Aβ в головном мозге R3PA и большей части гиппокампа.Смещение ингибирующего эффекта в области CA1 гиппокампа за счет повышенной экспрессии RTN3, вероятно, связано с предварительно сформированными агрегатами RTN3 в RIDN. Ранее мы продемонстрировали, что наличие RIDN в гиппокампе мышей Tg-RTN3 коррелирует с образованием и уровнями агрегатов RTN3 (Hu et al., 2007), и что BACE1 не взаимодействует с агрегатами RTN3 (He et al., 2006). ). Хотя предполагается, что BACE1 также маркирует дистрофические нейриты (Zhao et al., 2007), мы обнаружили, что RIDN не перекрывались с дистрофическими нейритами, маркированными антителом BACE1 (данные не показаны), что указывает на то, что BACE1 и агрегированный RTN3 частично разделены на две части. разные популяции нейритных областей.Так как RIDN образовывались раньше, чем амилоидные бляшки в наших моделях на животных, преформированные RIDN, по-видимому, отрицательно влияли на процесс отложения амилоида в области CA1.

    Снижение продукции Aβ у мышей Tg-R3PA

    Уровни Aβ, особенно Aβ 1–42, регулируют процесс отложения амилоида при AD (Golde and Younkin, 2001; Sisodia and George-Hyslop, 2002; Tomita and Iwatsubo, 2004). Как ранее сообщалось в исследованиях на мышах с БА, Aβ 1–42 гораздо легче агрегировать, чем Aβ 1–40, , а агрегированные Aβ 1–42 и Aβ 1–40 растворяются в гидрохлориде гуанидина (Jankowsky и другие., 2004). Чтобы измерить уровни Aβ 1–40 и Aβ 1–42 с помощью сэндвич-ELISA, общий Aβ экстрагировали из указанных образцов мозга мышей с помощью метода гидрохлорида гуанидина, как описано ранее (Wang et al., 2006). Уровни Aβ 1–40 (29,9 ± 1,97 против 39,6 ± 2,17 пмоль / г; p <0,05) и Aβ 1–42 уровней (377,4 ± 50,72 против 596,9 ± 14,68 пмоль / г; p <0,01 ) были значительно ниже в коре головного мозга мышей Tg-R3PA, чем у мышей Tg-PA (рис.4 А ). Примечательно, что соотношение Aβ 1–40 / Aβ 1–42 не изменилось (данные не показаны), что согласуется с нашим предыдущим наблюдением ингибирующих эффектов RTN3 на BACE1 in vitro (He et al., 2004 ). Уровни в гиппокампе нерастворимого Aβ 1–40 (39,4 ± 4,58 против 45,9 ± 6,44 пмоль / г; p = 0,229) и Aβ 1–42 (309,9 ± 42,60 против 364,3 ± 62,22 пмоль / г; p = 0,255) у мышей Tg-R3PA также были ниже, чем у мышей Tg-PA (рис.4 B ). Хотя, по-видимому, наблюдается меньшее снижение уровней Aβ, чем отложение амилоида, предыдущие исследования также показали аналогичные явления на других моделях животных, включая гетерозиготных мышей BACE1 (McConlogue et al., 2007). В целом, наши результаты ELISA коррелируют с иммуногистохимическими результатами, которые показывают снижение продукции и отложения Aβ в коре головного мозга мышей Tg-R3PA.

    Рисунок 4.

    Продукция Aβ была снижена у мышей Tg-RTN3. A , B , Уровни нерастворимого Aβ 1–40 и Aβ 1–42 , экстрагированного из кортикальных ( A ) и всего гиппокампа ( B ) тканей измеряли с помощью сэндвич-ELISA.Значения Aβ выражены как средняя концентрация Aβ ± SEM в пмоль / г. В то время как наблюдается значительное снижение как нерастворимого Aβ 1–40 , так и Aβ 1–42 в коре Tg-R3PA, разница в значениях нерастворимого Aβ в гиппокампе между мышами Tg-PA и Tg-R3PA была более умеренной ( * p <0,05, ** p <0,01, n = 3; t тест).

    Экспрессия трансгена RTN3 снижает продукты расщепления BACE1

    Мы также выполнили вестерн-блот-анализ экстрактов общего белка из гомогенатов коры головного мозга мышей Tg-PA и Tg-R3PA (возраст 6 месяцев), чтобы изучить уровни C-концевого продукта CTF99, расщепленного BACE1, который оценивали с помощью антител. узнавая либо конец Aβ N (6E10), либо конец APP C (A8717).Следует отметить, что полноразмерный APP мозга и секретируемые N-концевые фрагменты не были разделены на Вестерн-блоттинге. Общие уровни этих белков, по-видимому, существенно не изменились, что свидетельствует о том, что экспрессия АРР у мышей Tg-R3PA сравнима с таковой у мышей Tg-PA. В то время как уровень RTN3 был подтвержден как примерно в 4 раза выше в Tg-R3PA головного мозга, уровень APP CTF99 был заметно снижен, особенно когда 6E10 использовался для обнаружения человеческого APP CTF99 (фиг. 5 A ). Это небольшое снижение было четко продемонстрировано при сравнении соотношений CTF99 и CTF83 (1.97 ± 0,07 против 1,64 ± 0,12; p <0,05, n = 4) или общий APP (0,96 ± 0,04 для Tg-R3PA против 0,73 ± 0,07 для Tg-PA; p <0,05, n = 4). Напротив, общие уровни CTF99 в гиппокампе не были значительно снижены, что согласуется с морфологическими результатами и результатами Aβ (рис. 5 B ) (CTF99 / APP: 1,31 ± 0,07 в Tg-R3PA против 1,26 ± 0,03 в Tg-PA; p <0,05, n = 4). Таким образом, пониженное отложение амилоида у мышей R3PA объясняется сниженной активностью BACE1 у мышей R3PA и предварительно сформированными RIDN, влияющими на негативную модуляцию RTN3 при обработке APP.

    Рисунок 5.

    паттернов обработки APP в мозге мышей Tg-PA и Tg-R3PA. A , B , равные количества белковых экстрактов из коры головного мозга ( A ) или гиппокампа ( B ) 180-дневных мышей Tg-PA и Tg-R3PA были исследованы методом вестерн-блоттинга. Антитело 6E10 распознает полноразмерный APP и продукт трансгена человеческого APP CTF99, расщепленный BACE1. BACE1 выявляется с помощью антитела B279. Антитело A8717, специфичное к C-концу APP, использовали для обнаружения полноразмерного APP, его фрагментов CTF99 и CTF83.Антитела, распознающие β-актин и калнексин, использовали для проверки равной нагрузки.

    Измененная локализация BACE1 в субклеточных компартментах после сверхэкспрессии RTN3

    Хотя оба наших исследования in vitro и in vivo продемонстрировали, что повышенная экспрессия RTN3 будет связываться и отрицательно влиять на активность BACE1, препятствуя доступу BACE1 к его субстрату APP, физиологическая функция RTN3 во время его взаимодействия с BACE1 все еще остается не понятно.Для дальнейшего решения этого механистического вопроса мы протестировали потенциальную роль RTN3 в клеточном трафике, как обсуждалось ранее (Wakana et al., 2005). Мы предположили, что клеточное распределение BACE1 будет затронуто, если повышенная экспрессия RTN3 изменит трафик BACE1. Чтобы исследовать потенциальное влияние RTN3 на внутриклеточную локализацию BACE1, мы сначала выполнили центрифугирование в градиенте сахарозы для фракционирования клеточных компартментов клеток HEK-293 и HR3M. Клетки HR3M были созданы путем стабильной экспрессии RTN3 в клетках HEK-293 (He et al., 2007). Наш результат показал, что в клетках HR3M большая часть BACE1 локализована во фракциях ER, оставляя небольшое количество BACE1 во фракциях Golgi (Fig. 6 A ). Напротив, значительная часть BACE1 была локализована в Golgi клеток HEK-293 (фракции 3 и 4), а гораздо меньшая часть была локализована в ранних эндосомах (фракция 2), что согласуется с предыдущими сообщениями (Creemers et al. ., 2001; Ян и др., 2001; Пасторино и др., 2002). Мы также обнаружили, что эндогенные уровни APP, детектируемые с помощью антитела A8717, были в основном во фракциях, содержащих ER и белки плазматической мембраны в обоих случаях, но были более очевидными в клетках HR3M.Следует отметить, что уровни полноразмерных APP были выше в клетках HR3M, чем в клетках HEK-293, что согласуется с нашими предыдущими сообщениями о том, что повышенная экспрессия RTN3 повышает уровни полноразмерных APP в культивируемых клетках (He et al., 2004 ) и седалищных нервов (Shi et al., 2009).

    Рисунок 6.

    Измененное клеточное распределение BACE1 после сверхэкспрессии RTN3. A . После трансфекции плазмидной ДНК, экспрессирующей ВАСЕ1, в течение 24 часов клетки HEK-293 и HR3M гомогенизировали и постнуклеарный супернатант фракционировали в равновесном градиенте сахарозы.Фракции (12 × 1 мл) собирали сверху градиента, 400 мкл каждой фракции осаждали ледяным метанолом, затем белки разделяли на 4–12% гелях Bis – Tris NuPAGE с последующим иммуноблоттингом с использованием антител против BACE1 (B279), APP (C-терминал APP) и RTN3 (R458), как указано. Калнексин, β-COP, TGN38 и EEA1 служили белковыми маркерами для ER, Golgi, trans -Golgi network (TGN) и ранней эндосомы (EE), соответственно. Маркеры молекулярной массы указаны в килодальтонах слева на панели. B , клетки HM, которые стабильно экспрессируют BACE1, трансфицировали RTN3 или пустым вектором в течение 48 часов, и клетки подвергали субклеточному фракционированию с помощью градиента йодиксанола. Измененное обогащение BACE1 в ранних эндосомных компартментах является наиболее заметным. Измененные полосы белка, распознаваемые C-концевым антителом APP, также указаны стрелкой. Этот фрагмент белка не обнаруживался в клетках HEK-293, которые использовали для генерации клеток HM. Было указано обогащение EEA1 (ранний эндосомальный маркер), β-COP (маркер компартмента Гольджи) и калнексина (ER).

    Для дальнейшего подтверждения этого наблюдения мы трансфицировали либо пустой вектор, либо конструкцию экспрессии RTN3 в клетки HM, которые стабильно экспрессируют BACE1. После трансфекции в течение 48 часов эти клетки подвергали субклеточному фракционированию с использованием метода градиента йодиксанола в соответствии с процедурами, описанными ранее (Xia et al., 1998). Мы обнаружили, что BACE1 демонстрирует бимодальное распределение во фракциях ER и Golgi в ​​клетках, трансфицированных контролем, но значительно больше BACE1 было обогащено в компартментах ER, когда RTN3 был значительно сверхэкспрессирован (рис.6 B ).

    Ранее было показано, что небольшой процент BACE1 обнаруживается на поверхности клетки (Huse et al., 2000; Yan et al., 2001; Kinoshita et al., 2003; Hu et al., 2006; Zou et al., ., 2007). Потенциально повышенное удержание BACE1 в отсеке ER может снизить поверхностную экспрессию BACE1. Чтобы проверить эту возможность, мы сравнили локализацию BACE1 на клеточной поверхности в клетках HEK-293 или клетках HR3M с использованием биотинового мечения поверхностных белков. Чтобы подтвердить это, мы временно трансфицировали эти две клеточные линии равными количествами HA-меченой конструкции экспрессии BACE1 человека, и трансфекции позволяли продолжаться в течение 24 часов.Затем белки клеточной поверхности биотинилировали, как описано ранее (Yan et al., 2001), и биотинилированные белки специфически удаляли с помощью гранул нейтравидина для вестерн-блоттинга. Хотя экспрессия HA-меченного BACE1 в клетках HR3M была аналогична экспрессии в клетках HEK-293, отношение поверхностного BACE1 к общему клеточному BACE1 было значительно ниже в клетках HR3M по сравнению с клетками HEK-293 (фиг.7 A ). . Основываясь на количественной оценке в трех независимых сериях экспериментов, мы обнаружили, что 5.49 ± 0,679% общего клеточного BACE1 в клетках HEK-293 было обнаружено на поверхности клетки, но только 1,36 ± 0,0694% общего BACE1 в клетках HR3M было обнаружено на поверхности клетки, что отражает уменьшение на 55% поверхности BACE1 после увеличения экспрессия RTN3 (рис.7 B ) ( p <0,01, n = 3). В альтернативном эксперименте клетки НМ, стабильно экспрессируемые ВАСЕ1, временно трансфицировали либо плазмидной ДНК RTN3, либо пустым вектором в течение 48 часов. Эксперименты по биотинилированию и вытеснению проводили таким же образом, как указано выше.В соответствии с данными, изложенными выше, мы наблюдали значительное снижение поверхностного BACE1 в клетках после сверхэкспрессии RTN3 (фиг. 7 D , E ). Процент поверхностного ВАСЕ1 в общем ВАСЕ1 составлял 7,67 ± 0,649% в контроле, тогда как он снижался до 3,40 ± 0,486% при сверхэкспрессии RTN3.

    Рисунок 7.

    Уменьшение клеточной поверхности BACE1 после сверхэкспрессии RTN3. A , Вектор, экспрессирующий BACE1 человека, временно трансфицировали в клетки HEK-293 (293) и клетки HEK-293, сверхэкспрессирующие RTN3 (HR3M), с последующим биотинилированием поверхностных белков в живых клетках в соответствии со стандартными процедурами.Биотинилированные поверхностные белки были отделены от небиотинилированных белков с использованием гранул нейтравидина. Суммарные белки клеточных лизатов и биотинилированные белки анализировали на Вестерн-блоттинге с использованием специфических антител. С каждой клеточной линией было проведено три независимых эксперимента и проанализировано на одном и том же блоте. Калнексин служил контролем загрузки. B , C , Общие клеточные и поверхностные уровни BACE1 ( B ) и APP ( C ) были рассчитаны как интегрированное значение плотности (IDV) и нормализованы к IDV. калнексина.Процентное содержание двух белков на поверхности клетки представлено соответственно в виде гистограмм. Результаты были обобщены из трех серий экспериментов ( p <0,01). D , клетки НМ, экспрессирующие BACE1, временно трансфицировали плазмидной ДНК RTN3 или вектором pcDNA3.1 (помеченным как вектор) в течение 48 часов. Биотинилирование поверхностного белка и нейтравидиновый отбор выполняли тем же способом, что и описанный выше. Стоит отметить, что без биотинилирования поверхностные белки не были обнаружены в элюатах из колонки с нейтравидином. E , F . Общие клеточные и поверхностные уровни BACE1 ( E ) и APP ( F ) также были рассчитаны как IDV и нормализованы к IDV калнексина. Процентное соотношение двух белков на поверхности клетки к их общему количеству белков в лизатах соответственно представлено в виде столбчатых диаграмм ( E ) и ( F ). ( n = 6; p <0,05).

    Ожидается, что более высокие уровни RTN3 уменьшат обработку BACE1 приложения.В соответствии с этим, общий полноразмерный APP действительно был значительно выше в клетках HR3M, чем в клетках HEK-293 ( p <0,01, n = 3, t тест) (Рис.7 A , D ). Мы также подтвердили, что уровни мРНК APP в этих двух клеточных линиях были схожими (данные не показаны), тем самым подтверждая, что этот повышенный уровень полной длины APP вызван сниженным процессингом BACE1, как обсуждалось ранее (He et al., 2004 ; Murayama et al., 2006). Интересно, что клеточный трафик APP также был изменен, о чем свидетельствует измененное субклеточное фракционирование (рис.6 A ) и процентное содержание APP на поверхности клетки (рис.7 C , F ) ( p <0,01, n = 3). Этот сниженный поверхностный уровень АРР в клетках соответствовал наблюдению фракционирования по градиенту сахарозы.

    В целом, мы продемонстрировали, что повышенная экспрессия RTN3 действительно изменяет клеточный трафик BACE1 и APP. Повышенное удерживание BACE1 в отсеке ER также не способствует оптимальной переработке APP BACE1, что требует кислой среды pH.В отличие от BACE1, на перенос APP через мембрану могла косвенно повлиять повышенная экспрессия RTN3, поскольку прямое взаимодействие между RTN3 и APP не было обнаружено. Способствует ли измененное взаимодействие между BACE1 и APP после избыточной экспрессии RTN3 измененному клеточному перемещению APP, еще предстоит исследовать.

    Обсуждение

    Белки

    RTN представляют собой группу интегральных мембранных белков, преимущественно связанных с ER (Oertle et al., 2003; Yan et al., 2006). Хотя их биологические функции остаются плохо изученными, различные биохимические и функциональные исследования предполагают различные потенциальные роли этих белков, включая формирование канальцевого ER, регулируемый перенос белков везикул, рост нейритов и экзоцитоз (Chen et al., 2000; GrandPré et al. al., 2000; Steiner et al., 2004; Voeltz et al., 2006; Hu et al., 2007; Киселева и др., 2007). Измененные уровни экспрессии RTN обнаруживаются при различных болезненных состояниях, включая неврологические расстройства (Bandtlow et al., 2004; Фергани и др., 2005; Ян и др., 2006). Мы и другие продемонстрировали, что RTN взаимодействуют с BACE1 и негативно модулируют активность протеазы BACE1 (He et al., 2004, 2006; Murayama et al., 2006; Wojcik et al., 2007; Kume et al., 2009). В настоящем исследовании мы также продемонстрировали, что повышенная экспрессия RTN3 в наших моделях мышей значительно снижает продукцию Aβ, отложение амилоида и нагрузку на бляшки. В частности, сверхэкспрессия RTN3 у мышей Tg-R3PA значительно уменьшала количество нейритных бляшек Aβ на ∼55% в коре головного мозга, на 50% в области CA3 и на 44% в области зубчатой ​​извилины по сравнению с теми же областями в Tg. -ПА мыши.Однако наши результаты являются первыми, которые предполагают, что предварительно сформированные RIDN в основном в области Tg-R3PA CA1 отрицательно влияют на негативную модуляцию BACE с помощью RTN, тем самым влияя на процесс отложения амилоида. Существует множество потенциальных механизмов, которые могут вызывать образование дистрофических нейритов у пациентов с БА, и образование RIDN коррелирует с образованием агрегатов RTN3. Наши результаты предполагают, что ингибирование агрегации RTN3 уменьшит образование RIDN и отложение амилоида при AD.

    RIDNs у мышей Tg-RTN3 возникают уже в возрасте 3 месяцев (Shi et al., 2009), что раньше, чем начало образования бляшек Aβ у мышей Tg-PA (возраст ~ 5-6 месяцев). Область СА1 гиппокампа является преобладающей областью этого образования. В нашем исследовании уровни экспрессии RTN3 в гиппокампе и коре головного мозга были сопоставимы (рис. 1), хотя большинство RIDN развились в области CA1 гиппокампа, и только несколько RIDN были разбросаны в коре головного мозга. Наблюдаемое биохимическое различие между гиппокампом и корой головного мозга, возможно, связано с существованием большого количества агрегатов RTN3 в гиппокампе, но не в коре головного мозга мышей Tg-R3PA (Hu et al., 2007). Остается определить, почему гиппокамп более чувствителен к образованию агрегатов RTN3. Однако из-за этого различия общий положительный эффект сверхэкспрессии RTN3 был значительно снижен в гиппокампе мышей Tg-R3PA, поскольку уровни нерастворимого Aβ 1–40 и Aβ 1–42 , а также количества дистрофического Aβ бляшки были опущены в меньшей степени. Недавно мы продемонстрировали, что агрегированный RTN3 не взаимодействует с BACE1, тогда как свободная форма RTN3 связывается с BACE1 и ингибирует его (He et al., 2006), указывая на то, что мономерный статус является критическим для ингибирующей функции BACE1 в отношении RTN3. RTN3 принимает ω-образную структуру с двумя концами, обращенными к цитозольной стороне (He et al., 2007), и его C-концевой мотив QID (глутамин, изолейцин, аспарагиновая кислота) необходим для взаимодействия с C-концевой мембраной BACE1. -проксимальная область (He et al., 2006). Взаимодействие RTN3 с BACE1 необходимо для ингибирующей роли RTN3 в ослаблении BACE1-опосредованного процессинга APP. Поскольку основным компонентом RIDN является агрегированный RTN3, образование RIDN в большом масштабе снижает доступный мономер RTN3 внутриклеточно, что, в свою очередь, освобождает BACE1 от RTN3-опосредованного ингибирования.

    Если преформирование RIDN в гиппокампе мышей можно избежать, индукция экспрессии RTN3 может быть альтернативным подходом для достижения уменьшения отложения амилоида. Мы обнаружили, что сверхэкспрессия RTN3 в областях, отличных от CA1, в достаточной степени вызвала уменьшение образования амилоидных бляшек, хотя и не полностью блокировала продукцию Aβ. Было показано, что частичное снижение активности BACE1 снижает отложение амилоида (Laird et al., 2005; Singer et al., 2005; McConlogue et al., 2007), и наши результаты согласуются с этими наблюдениями.Следует также отметить, что модель APP, использованная в настоящем исследовании, отличается от мышей PDAPP или Tg-2576, использованных в вышеуказанных публикациях, но обычно считается, что ингибирование BACE1 снижает отложение амилоида.

    Механизм, с помощью которого повышенная экспрессия RTN3 снижает процессинг BACE1 APP, был исследован путем тестирования потенциальной роли RTN3 в транспортировке мембранных белков. Генетические исследования показывают, что семейство белков RTN может формировать трубчатые структуры (Voeltz et al., 2006; Tolley et al., 2008), но другие исследования показывают, что RTN-белки могут влиять на транспорт везикул посредством взаимодействия с белками-переносчиками везикул (Iwahashi and Hamada, 2003; Steiner et al., 2004; Wakana et al., 2005; Liu et al. , 2008). Наше настоящее исследование показало, что повышенная экспрессия RTN3 вызывает удержание большего количества BACE1 в компартментах ER и снижает перенос BACE1 на поверхность клетки. Возможное объяснение этого измененного трафика состоит в том, что RTN3 не является быстро подвижной молекулой транспорта ER, а взаимодействие между RTN3 и BACE1 заставляет BACE1 медленно переходить из ER в поздние секреторные компартменты.В соответствии с этим наблюдением мы обнаружили, что поверхность BACE1 значительно уменьшалась, когда RTN3 был сверхэкспрессирован. Интересно, что на клеточный трафик APP также влияет избыточная экспрессия RTN3 (фиг. 6, 7). Хотя RTN3 не взаимодействует с APP напрямую, основываясь на наших экспериментах по совместному IP (He et al., 2004), повышенное удержание APP в ER может быть связано с повышенными уровнями BACE1 в ER в этом случае и взаимодействием между APP и BACE1 может косвенно сохранить больше APP в ER.Повышенное удержание APP в ER объясняет несколько сниженные уровни CTF83, продукта обработки APP α-секретазой, как показано на рисунке 1.

    Ожидается, что изменение внутриклеточного транспорта и локализации BACE1 повлияет на метаболизм АРР и продукцию Aβ. Обычно большая часть BACE1 присутствует в сети trans -Гольджи и эндосомах, тогда как остальная часть находится на поверхности клетки и в ER (Vassar et al., 1999; Lin et al., 2000; Creemers et al. , 2001; Walter et al., 2001; Ян и др., 2001). Расщепление APP по β-сайту с помощью BACE1 происходит как в ранних секреторных компартментах, так и в эндоцитарных путях (Shi et al., 2001; Yan et al., 2001; Huse et al., 2002; Kinoshita et al., 2003; He et al., др., 2005). Следовательно, больше BACE1 накапливается в среде ER, в которой процессинг APP BACE1 находится в менее благоприятных условиях pH, как предполагалось ранее (Hussain et al., 1999; Sinha et al., 1999; Vassar et al., 1999; Yan et al., 1999; Lin et al., 2000). Ожидается, что повышенное удержание BACE1 в ER усилит деградацию BACE1, как было недавно предложено (Tesco et al., 2007). Возможно, тесное взаимодействие RTN3 с BACE1 предотвращает не только доступ BACE1 к его субстрату APP для правильной обработки, но и его деградацию. В то время как повышенные уровни RTN3 могут удерживать BACE1 в отсеке ER, неясно, требуется ли для выхода BACE1 из отсека ER RTN3. Полный дефицит RTN3 и членов его семейства будет протестирован для решения этого вопроса.

    Таким образом, наши результаты установили двойную роль RTN3 in vivo , и наши результаты предполагают, что измененный клеточный трафик BACE1 in vitro и in vivo также может объяснить снижение продукции Aβ и его отложение в головной мозг.Важно отметить, что наши результаты также показывают, что предварительно сформированные RIDN будут неблагоприятно способствовать продукции Aβ, и более высокие уровни RIDN, чем амилоидные бляшки, уже были обнаружены в области гиппокампа посмертного мозга при БА (Shi et al., 2009). Следовательно, предотвращение образования RIDN будет необходимым шагом для усиления эффекта RTN3 на отложение амилоида.

    Сноски

    • Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения Р.Ю. (AG025493) и награды от Фонда Ральфа Уилсона и Ассоциации Альцгеймера Р.Y. Q.S. частично поддерживается премией молодых исследователей от Национального альянса по исследованию шизофрении и депрессии и M.P. поддерживается постдокторской стипендией Американского фонда помощи в области здравоохранения. Мы благодарим доктора Сяндун Чжоу за большую помощь во время исследований и Криса Нельсона за критическое прочтение этой рукописи. Доктор Роберт Вассар (Северо-Западный университет) предоставил нам BACE1-специфическое моноклональное антитело, которое использовали для конфокального окрашивания BACE1 в образцах мозга.

    • Переписку следует направлять доктору Рицян Яну, Отдел неврологии, Исследовательский институт Лернера, Фонд клиники Кливленда, 9500 Евклид-авеню, Кливленд, Огайо, 44195. yanr {at} ccf.org

    От непептидов к ингибиторам неуглеродных протеаз: металлакарбораны как специфические и сильные ингибиторы протеазы ВИЧ

    Abstract

    Протеаза (PR) ВИЧ представляет собой главную мишень для рационального дизайна лекарств, а ингибиторы протеазы (PI) являются мощными противовирусными препаратами.Большинство существующих ИП представляют собой псевдопептидные соединения с ограниченной биодоступностью и стабильностью, и их использование затруднено из-за высокой стоимости, побочных эффектов и развития устойчивых штаммов. В нашем поиске новых структур PI мы определили группу неорганических соединений, икосаэдрических металакарборанов, как кандидатов в новый класс непептидных PI. Здесь мы сообщаем о мощном, специфическом и селективном конкурентном ингибировании PR ВИЧ замещенными металлакарборанами. Наиболее активное соединение, натрий-водород-бутилимино-бис-8,8- [5- (3-окса-пентокси) -3-кобальт бис (1,2-дикарболлид)] диат, показал значение K i . из 2.2 нМ и субмикромолярный EC 50 в противовирусных тестах, не показали токсичности в культуре тканей, слабо ингибировали человеческий катепсин D и пепсин и были неактивны в отношении трипсина, папаина и амилазы. Структура исходного бис (1,2-дикарболлида) кобальта в комплексе с PR ВИЧ была определена с разрешением 2,15 Å с помощью кристаллографии белков и представляет собой первую определенную структуру карборан-белкового комплекса. Он показывает следующий способ ингибирования PR: две молекулы исходного соединения связываются с гидрофобными карманами в проксимальной к лоскуту области S3 и S3 ‘субсайтов PR.Поэтому мы предлагаем, чтобы эти соединения блокировали закрытие клапана в дополнение к заполнению соответствующих карманов для связывания, как обычные ИП. Этот тип связывания и ингибирования, химическая и биологическая стабильность, низкая токсичность и возможность введения различных модификаций делают кластеры бора привлекательными фармакофорами для сильного и специфического ингибирования ферментов.

    Протеаза ВИЧ (PR) отвечает за расщепление предшественников вирусных полипротеинов на зрелые функциональные вирусные ферменты и структурные белки.Этот процесс, называемый созреванием вируса, необходим для того, чтобы вирион-потомок стал репликационно-компетентным и заразным. Химическое ингибирование или инактивация путем мутации PR блокирует инфекционность вируса (1). Таким образом, PR стал основной целью терапевтического вмешательства при СПИДе. Академические и промышленные исследования привели к быстрой разработке восьми эффективных ингибиторов, которые в настоящее время используются в клинической практике, а несколько других все еще находятся в стадии разработки (для обзора см. Ссылки 2 и 3).

    Несмотря на значительный успех рационального дизайна лекарств, потребность в эффективных ингибиторах PR (ИП) все еще актуальна.Большинство современных ИП представляют собой псевдопептидные соединения с ограниченной биодоступностью и стабильностью. Более того, их клиническое использование затруднено из-за высокой стоимости производства, различных побочных эффектов и быстрого развития устойчивых вирусных штаммов (4). Следовательно, существует постоянная потребность в разработке новых ИП с упором на широкую специфичность против устойчивых к ИП мутантов ВИЧ (5, 6).

    Молекулярное моделирование и / или случайное тестирование библиотек соединений выявили несколько ингибиторов PR с неожиданной структурой.Большинство ИП первого поколения были псевдопептидами. Некоторые недавние соединения включают непептидные структуры, такие как циклические мочевины, сульфаниламиды и т. Д. (2). Однако даже неорганические соединения, Nb-содержащие полиоксометаллаты, специфически ингибируют PR ВИЧ с субмикромолярными значениями EC 50 в тканевых культурах (7). В этом случае было показано, что ингибиторы неконкурентоспособны, и модель предполагала связывание с катионным карманом на внешней поверхности лоскутов. Также имеются данные о соединениях с неожиданным химическим составом, способных воздействовать на активный центр фермента.Было показано, что PR-связывающая щель ВИЧ вмещает фуллерены C 60 , гидрофобные и электрофильные сферические соединения, а некоторые производные фуллерена действительно являются слабыми ингибиторами PR ВИЧ (8-11).

    Мы искали другие типы нетрадиционных химических структур, которые могли бы вписаться в PR-связывающую щель, были бы биологически стабильными и обеспечивали бы легкую химическую модификацию. При скрининге ряда структурных мотивов мы идентифицировали группу неорганических соединений, икосаэдрических боранов, карборанов, а именно 12-вершинные металлические бис (дикарболлиды), как многообещающие каркасы для нового класса непептидных ИП.Эти бор / углеродные кластеры представляют собой многогранники, основанные на трехмерном каркасе с треугольными гранями.

    Борсодержащие полиэдрические соединения интенсивно изучаются в связи с их использованием в борной нейтронно-захватной терапии (12) и в радиовизуализации (13, 14). Со структурной точки зрения множество известных структурных типов боранов, гетероборанов и металлоборанов представляет собой интересный аналог органических соединений, особенно ароматических соединений. Поскольку икосаэдрическая клетка лишь немного больше, чем огибающая вращения фенильного кольца, карбораны использовались в качестве стабильных гидрофобных фармакофоров (например,г., исх. 15-17). Информации об использовании карборанов в качестве ингибиторов ферментов мало. Немногочисленные примеры, приведенные в литературе, включают бензолактамы, содержащие дикарба-, клозо -додекаборан (16, 18) или карборановое замещение фенильного кольца в фенил-фталимидоимиде, что дает модулятор фактора некроза опухоли-α с активностью, сравнимой с исходным соединением. (19). Порфирины, замещенные дикарба-, клозо -додекаборанами, были обнаружены как ингибиторы PR ВИЧ с IC 50 в субмикромолярном диапазоне (20).

    Наше основное внимание было сосредоточено на ионных бис (дикарболлидах) металлов, которые состоят из двух субкластеров дикарболлидов, окружающих центральный атом металла. В бис (дикарболлидах) металлов равные 11-вершинные подкластеры дикарболлидов соединены металлической вершиной commo , образуя два 12-вершинных подкластера металлических дикарболлидов. Эти closo 26-электронные соединения с «арахисоподобной 12-вершинной геометрией» были описаны еще в 1965 году Хоторном и др. . (21) и, таким образом, образуют основные камни в химии металлакарборанов.

    Среди других металлакарборанов переходных металлов (22), бис (1,2-дикарболлид) ион кобальта (23) демонстрирует некоторые уникальные особенности: синтетическую доступность, широкие возможности экзо -скелетных модификаций, высокую стабильность, делокализацию заряда, низкую нуклеофильность. , сильная кислотность сопряженных кислот и высокая гидрофобность. Эти свойства отражаются в уникальных свойствах раствора и образовании пар этого иона, что, в свою очередь, привело к его известным приложениям в экстракционной химии (24, 25), а также к разработке низкокоординируемых анионов (26) и соединений для радиовизуализации (14). ).Однако бис (дикарболлиды) металлов никогда не рассматривались как биологически активные соединения или фармакофоры.

    В этой статье мы сообщаем о мощном, специфическом и селективном ингибировании PR ВИЧ родительскими и замещенными металлакарборанами, а именно бис (1,2-дикарболлидами) кобальта. Мы предоставляем доказательства механизма действия этих соединений, демонстрируем их противовирусную активность в тканевых культурах, анализируем их связывание с ферментом с помощью рентгеновской кристаллографии и показываем потенциал этого класса соединений, чтобы стать новым фармакофором для ингибирования ферментов.

    Материалы и методы

    Химический синтез. Соединение 1 (таблица 1) было преобразовано в натриевую соль из коммерчески доступной цезиевой соли (Katchem, Rez u Prahy, Чешская Республика) с использованием процедуры экстракции, описанной в ссылке. 27. Соединение 2 было получено прямым гидроксилированием 1 с использованием теплой разбавленной серной кислоты в соответствии с процедурами, описанными в ссылке. 28. Исходное промежуточное соединение диоксаната получали, как описано в ссылке.29. Синтез соединений 3-6 описан в Вспомогательные материалы и методы , который опубликован в качестве вспомогательной информации на веб-сайте PNAS.

    Таблица 1. Структура и активность ингибиторов металлакарборана

    Ферменты. Экспрессия, рефолдинг и очистка PR ВИЧ-1, PR ВИЧ-2 и варианта PR ВИЧ-1 (Q7K, L33I, L63I), несущего три мутации, которые минимизируют автопротеолитическое расщепление (30), были выполнены, как описано (31 ). PR из интрацистернальных А-частиц мыши (MIA14 PR) (32), катепсина D человека и пепсина получали, как описано (33, 34).Свиной α-амилазу, бычий трипсин и папаин были приобретены у Sigma.

    Анализы ингибирования. Подавление PR ВИЧ. Значения IC 50 и K i определяли спектрофотометрическим анализом с хромогенным субстратом KARVNleNphEANle-NH 2 , как описано (31). Константы ингибирования оценивали с использованием уравнения конкурентного ингибирования в соответствии с исх. 35. Механизмы ингибирования были получены из начальных скоростей реакции в зависимости от концентраций субстрата в присутствии различных концентраций ингибитора с использованием графика Лайнуивера-Берка.

    Ингибирование протеазы MIA14. Спектрофотометрический анализ использовали для определения характеристик ингибирования с использованием хромогенного субстрата DSAYNphVVS, как описано (32).

    Ингибирование человеческого катепсина, пепсина, трипсина, папаина и α-амилазы. Подробнее об экспериментах см. Вспомогательные материалы и методы .

    Тестирование противовирусной активности в тканевых культурах. Противовирусную активность анализировали с использованием клеток PM-1, инфицированных штаммом ВИЧ-1 NL4-3, модифицированным по опубликованной методике (36).Клетки PM-1 инфицировали сокультивированием и промывали через 4 часа после заражения, и после промывки добавляли соединения , 1-6, или растворитель ДМСО, соответственно. Новый продуцируемый вирус собирали через 48 часов после инфицирования и очищали коротким центрифугированием, и инфекционный титр определяли на клетках TZM, которые экспрессируют β-галактозидазу с Tat-чувствительного промотора. Титры вирусов и стандартные отклонения получены в трех независимых экспериментах.

    Кристаллизация, сбор данных и структурное решение. Комплекс для кристаллизации получали смешиванием PR ВИЧ-1 (Q7K, L33I, L63I) с 3,7-кратным молярным избытком соединения 1 , растворенного в ДМСО, и концентрировали ультрафильтрацией до конечной концентрации 7,5 мг / мл. Кристаллы выращивали методом диффузии паров висячей капли при 19 ° C с использованием 0,1 М трис · HCl (pH 8,5) и 2,0 М дигидрофосфата аммония в качестве раствора для осаждения. Дифракционные данные собирали при 100 K с использованием синхротронного излучения с длиной волны 0.8 Å [канал X13, Deutsches Elektronen-Synchrotron (DESY), Гамбург, Германия] и были обработаны с использованием пакета программ hkl 2000 (37). Структура PR ВИЧ была решена путем молекулярной замены с использованием белковых координат из Protein Data Bank (PDB) структуры 1NH0 (38). Решение и уточнение структуры проводились с помощью пакета программ ccp4.

    Параметры кристалла и статистика сбора данных сведены в Таблицу 2. Координаты атомов и структурные факторы депонированы в PDB: код 1ZTZ.Подробности определения структуры приведены в Таблице 4, которая опубликована в качестве вспомогательной информации на веб-сайте PNAS.

    Таблица 2. Сбор данных и статистика уточнения для определения кристаллографической структуры.

    Результаты и обсуждение.

    Дизайн и синтез ингибитора. Большинство ИП ВИЧ, используемых в настоящее время в клиниках, представляют собой псевдопептиды или пептидные миметики, основанные на ограниченном количестве структурных строительных блоков. Наше намерение состояло в том, чтобы идентифицировать новые основные структуры и, таким образом, расширить химическое пространство, доступное для разработки ИП с новыми качествами.Мы определили 12-вершинные металлокарборановые кластеры как подходящие гидрофобные, стабильные, нетоксичные структурные аналоги ароматических соединений. В наших первоначальных испытаниях замещенные металлакарбораны показали наиболее многообещающие результаты.

    Наш синтетический подход начался с легкодоступного исходного бис (дикарболлида) иона кобальта 1 с получением либо 8-гидроксипроизводного 2 (28), либо бис (1,2-дикарболлида) 8-диоксан-3-кобальта (29 ) реагент 7 (см. рис.1). Затем этот реагент прореагировал в мягких условиях, что дало серию экзо -скелетно-модифицированных металлакарборановых кластерных анионов 3-6 для тестирования.Для синтеза соединений 3-6 использовали реакцию расщепления кольца 7 с помощью O — и N -нуклеофилов (см. Рис. 1), в результате чего образуются ионные частицы, если открывателем кольца является анион, и цвиттерионы бетаинового типа, если база не заряжена.

    Рис. 1.

    Реакция раскрытия цикла бис (1,2-дикарболлида) 8-диоксан-3-кобальта 7 различными нуклеофилами Nu 0 (например, NH 3 ) и Nu (например, , RO ) с образованием цвиттерионных и анионных соединений соответственно.

    Процедура раскрытия цикла цвиттер-иона 7 уже стала широко применяемым методом присоединения фрагмента бис (дикарболлида) кобальта к различным органическим веществам (39-41). Однако соединения 5 и 6 представляют собой примеры цвиттерионно-анионных структур, содержащих две субъединицы бис (1,2-дикарболлида) кобальта, связанные через гибкую органическую спейсерную цепь.

    Константы ингибирования и противовирусная активность. Соединения 1-6 были протестированы как потенциальные ингибиторы ВИЧ PR in vitro и в тканевых культурах.Соответствующие константы ингибирования (значения K, , и ) и противовирусные активности (значения EC 50 ) сведены в Таблицу 1. Все соединения демонстрируют классическое конкурентное связывание (данные показаны в Вспомогательные материалы и методы и на рис. который публикуется в качестве вспомогательной информации на веб-сайте PNAS). Этот кинетический анализ предполагает, что тестируемый бис (дикарболлид) кобальта конкурирует с пептидным субстратом и, следовательно, связывается с активной щелью фермента.Это предположение подтверждено рентгеноструктурным анализом комплекса PR ВИЧ с соединением 1 (см. Ниже). Исходное соединение 1 демонстрирует сильное ингибирование in vitro и микромолярную противовирусную активность. Дериватизация соединения 1 гидроксильными и 2- (2-гидроксиэтокси) этоксигруппами дала соединения 2 и 3 , проявляющие гораздо более слабую активность in vitro и сопоставимые противовирусные активности в тканевых культурах. Простой визуальный осмотр размера соединений 1-3 (таблица 1) в сравнении с объемом закрытой формы активной щели PR ВИЧ привел к выводу, что эти соединения не будут иметь достаточных контактов с соответствующим связывающим субстратом. расщелины.Доступная для растворителя площадь соединения 1 более чем в два раза ниже по сравнению с типичным обычным псевдопептидом PI, лопинавиром (LPV). Однако рентгеноструктурный анализ разрешил это очевидное противоречие, показав, что для эффективного связывания с активной щелью PR необходимы две единицы ингибитора (см. Фиг. 2 и 3). Поскольку относительный молекулярный вес соединения -1 является одним из самых низких, когда-либо сообщаемых для ингибирования PR ВИЧ, он дает достаточно возможностей для дальнейшего улучшения посредством анализа структуры-активности, и поэтому оно было выбрано в качестве ведущего соединения в нашей серии исследований. металакарборановые ингибиторы PR ВИЧ.

    Рис. 2.

    Рентгеноструктурный анализ связывания соединения 1 с ВИЧ-PR. ( A ) Общая структура комплекса ВИЧ PR-соединение 1 . Димер PR представлен в виде ленты с двумя каталитическими аспартатами, показанными в виде стержней. Две молекулы соединения 1 представлены их поверхностями Ван-дер-Ваальса и моделью серого стержня с ионами кобальта, показанными в виде пурпурных сфер. Автопротеолитический пептидный продукт представлен в виде палочки. ( B ) Наложение комплекса PR-соединение 1 с комплексом PR-лопинавир и со свободной структурой PR.Комплекс протеазы с лопинавиром (код PDB ID 1MUI) представлен желтыми лентами, лопинавир показан в виде палочки, свободная структура PR (код PDB ID 1HHP) показана зелеными лентами, а цветовая кодировка для соединения PR 1 комплекса то же, что и в A .

    Рис. 3.

    Взаимодействия соединения 1 с аминокислотными остатками в соответствующем PR-связывающем кармане. ( A ) Связывание молекулы Cb1 соединения 1 PR-мономером A (красная пробирка).( B ) Связывание молекулы Cb2 соединения 1 PR-мономером B (синяя трубка). Соединение 1 представлено моделью стержня серого цвета, с кобальтом, показанным в виде пурпурной сферы. Остатки PR в контакте с соединением 1 представлены моделями палочек, а их доступные для растворителя поверхности окрашены зарядом атома (синий — положительный; красный — отрицательный). ( C ) Наложение двух соединений 1 -режим связывания. Цветовая схема и представление для PR такие же, как в A и B , а атомы в соединении 1 окрашены в цвет взаимодействующей PR-цепи.

    Примерно 100-кратное улучшение значения K i было достигнуто за счет увеличения боковой цепи соединения 3 в положении 8 клетки путем добавления 1,2-дифенил-2-гидрокси- этоксигруппа, давая соединение 4 с 20 нМ K i . Связывание соединения было дополнительно улучшено в четыре раза за счет конструирования симметричного соединения 5 и, даже более того, за счет алкилирования вторичной аминогруппы бутильным фрагментом (соединение 6 ), которое представляет собой наиболее активный ингибитор из ряда соединений. , со значением K i , равным 2.2 нМ и субмикромолярная противовирусная активность в культуре ткани. О способе связывания этого соединения и его взаимодействии с карманами связывания фермента можно судить по структуре исходного соединения 1 .

    Поразительно, что соединение 6 показало ЕС 50 для ингибирования ВИЧ-1 в культуре ткани 250 нМ, что в 10 раз лучше, чем наблюдаемое для структурно очень похожего соединения 5 . Напротив, значение K i для ингибирования PR in vitro показало только 2-кратную разницу.Этот результат указывает на то, что тонкие различия в структуре могут привести к значительным изменениям активности, и предполагает, что дальнейшее преобразование этой новой группы ИП может значительно повысить их потенциал в качестве антиретровирусных препаратов.

    Анализ процессинга полипротеина вестерн-блоттингом показывает дефект процессинга у вируса, выращенного в присутствии активных соединений (данные не показаны). Существенной токсичности тестируемых соединений в тканевых культурах не наблюдалось в диапазоне концентраций до 50 мкМ.

    Тестирование специфичности и селективности. Селективность ведущего соединения 1 и более сильнодействующих соединений 4-6 была протестирована на панели из семи ферментов, включая PR из высокогомологичного вируса ВИЧ-2, PR из более отдаленно родственного ретровируса MIA 14, прототип человеческий аспарагиновый PR, катепсин D и пепсин, сериновый PR, трипсин, цистеиновый PR, папаин и амилаза, как представитель непротеолитических ферментов с анионной щелью в активном центре. Результаты сведены в Таблицу 3 в виде значений IC 50 ; соответствующие значения K и показаны в скобках, когда это необходимо.

    Таблица 3. Значения IC 50 , которые демонстрируют специфичность и селективность отдельных соединений при анализе с другими ретровирусными PR, представителями аспарагиновых, сериновых и цистеиновых PR и амилазы

    . Все тестируемые соединения ингибируют гомологичные PR ВИЧ-2 и MIA PR. хотя и менее строго, что позволяет предположить, что они могут быть активны против мутировавших устойчивых видов PR, отобранных под давлением клинически используемых ИП у ВИЧ-положительных пациентов. Активность тестируемых соединений по отношению к катепсину D и пепсину на два порядка ниже по сравнению с PR ВИЧ-1 на уровне K, , и .Тестируемые соединения существенно не ингибируют какой-либо другой анализируемый фермент.

    Кристаллическая структура комплекса PR-соединение 1. Структура ВИЧ PR-соединение 1 комплекс определяли при разрешении 2,15 Å с коэффициентом R 17,6% и R свободным 23,6%. Последняя модель включает димер PR (цепи A и B) с двумя молекулами соединения 1 , связанными в активном центре (обозначены Cb1 и Cb2 на фиг. 2 A ). Поскольку соединение 1 обладает высокой симметрией по форме, тем не менее, невозможно однозначно различить положения атомов углерода и бора на картах электронной плотности при 2.Разрешение 15 Å.

    Если две молекулы соединения 1 связаны, общая конформация PR подобна открытой конформации, типичной для свободного PR. Большинство структур основанных на субстрате комплексов ингибиторов активного центра имеют створки, закрытые над активным центром. Однако PR в комплексе с 1 может быть наложен на структуру PR без лиганда [код PDB ID 1HHP (42)] со среднеквадратичным отклонением в положениях α-углерода 0,99 Å (рис. 2 B ). Лоскуты, очевидно, удерживаются в открытой конформации за счет связывания молекул ингибитора с проксимальной к лоскуту, «верхней» частью щели активного сайта (рис.2). Таким образом, структура свидетельствует о том, что неисследованный до сих пор класс ингибиторов демонстрирует неожиданный способ ингибирования. До сих пор открытая конформация лоскута сообщалась только для несвязанного PR, тогда как все связанные с ингибитором структуры PR HIV дикого типа демонстрируют конформацию закрытого лоскута. Здесь мы описываем структуру комплекса PR с относительно мощным ингибитором, однозначно связанным в открытой форме фермента. Поскольку конформация лоскута при PR функционально очень важна, это открытие может указывать на то, что механизм ингибирования этих соединений блокирует закрытие лоскута, а не заполняет специфические карманы связывания в щели активного сайта.

    Соединение 1 связано в гидрофобных карманах, образованных боковыми цепями остатков PR Pro-81, Ile-84 и Val-82 и покрытых остатками лоскута Ile-47, Gly-48 и Ile-54 ( Рис.3). Эти карманы приблизительно соответствуют субсайтам связывания субстрата S3 и S3 ‘. Хотя сайт связывания ингибитора идентичен в обоих мономерах, положения двух молекул соединения 1 различаются (фиг. 3 C ). Молекула ингибитора Cb1 составляет 21 ван-дер-ваальсов контакт с семью остатками мономера A (рис.3 A ), тогда как молекула ингибитора Cb2 устанавливает 12 ван-дер-ваальсовых контактов с четырьмя остатками мономера B (рис. 3 B ). В среднем 84% контактов приходится на неполярные атомы ПР. Две молекулы Cb1 и Cb2 контактируют друг с другом с помощью 3 ван-дер-ваальсовых контактов. Соединение 1 теряет 89% своей общей доступной для растворителя поверхности при образовании комплекса, и хорошая комплементарность формы между субсайтами S3 и S3 ‘PR и молекулами соединения 1 иллюстрируется средним индексом объема зазора, равным 0.45. Этот результат немного ниже среднего значения для комплексов фермент-ингибитор (43).

    Комплекс PR 1 , кристаллизованный в кристаллической форме C2, уникальной среди всех 169 структур PR ВИЧ, депонированных в PDB. В кристалле симметрично связанные PR-комплексы ориентированы друг к другу своими активными центрами. В результате такой кристаллической упаковки симметричные створки контактируют друг с другом, а молекулы соединения 1 находятся в контакте со своими партнерами по симметрии, а также со створками, принадлежащими соседней молекуле симметрии.Таким образом, помимо описанных выше контактов, взаимодействия соединения 1 с PR на основе кристаллических контактов можно наблюдать с остатками Gly-48, Gly-49, Ile-50 и Phe-53. Однако образование этих взаимодействий в растворе кажется маловероятным, поскольку сборка комплекса, состоящего из двух димеров PR и четырех молекул ингибитора, маловероятна.

    Пять остатков PR, которые находятся в контакте с соединением 1 , часто мутируют в устойчивые к лекарствам варианты PR (Ile-47, Ile-48, Ile-54, Val-82 и Ile-84).На вопрос, влияет ли присутствие этих мутаций на связывание соединения 1 , необходимо ответить с помощью дальнейших биохимических и структурных исследований. Тем не менее, соединение 1 двумя разными способами связывается с двумя идентичными связывающими карманами, образованными мономерами A и B (фиг. 3 C ). Таким образом, мы можем ожидать, что соединение 1 способно адаптировать свое положение так, чтобы оно могло связываться в соответствующий карман, измененный мутациями.

    В дополнение к двум молекулам ингибитора, непрерывная карта электронной плотности в нижней части активного сайта PR позволила моделировать тетрапептид Ala-Gly-Ala-Ala, который представляет собой продукт автопротеолитического расщепления PR, часто наблюдаемого во время сокристаллизации PR со слабыми ингибиторами активного центра.Затем продукт деградации PR обнаруживается в активном сайте вместо ингибитора (ссылка 46; код PDB ID 1SP5). Однако в настоящей структуре пептид и соединение 1 занимают разные сайты активной щели, и, следовательно, они могут связываться одновременно. Тем не менее, высокие температурные факторы атомов основной цепи пептида указывают на высокую подвижность и / или ее вероятную более низкую заселенность. Отсутствие электронной плотности для боковых цепей также предполагает, что в структуре присутствуют несколько пептидов, происходящих из трех возможных сайтов расщепления (44).Следовательно, мы предполагаем, что присутствие пептида в активном сайте не требуется для специфического связывания соединения 1 .

    В заключение, мы показали, что кластеры бора представляют собой удобные строительные блоки, которые могут создавать важные взаимодействия с гидрофобными участками PR-сайта связывания ВИЧ. Рентгеноструктурный анализ комплекса металлаборан-PR дает убедительные доказательства о сайте связывания ингибитора и типе взаимодействия. Exo -замена скелета родительского металлоорганического кластерного тектона вводит дополнительные нековалентные взаимодействия, ведущие к резкому повышению эффективности и селективности ингибирования.Комбинация гидрофобных взаимодействий каркаса с заменами, допускающими специфические Н-связывание и кулоновские взаимодействия, может дополнительно повысить эффективность этого класса непептидных ингибиторов PR на основе неорганического каркаса. Химическая и биологическая стабильность, низкая токсичность и возможность введения гетероатомов в клетку или модификации полярных групп в боковых цепях делают кластеры бора очень привлекательными фармакофорами.

    Благодарности

    Мы благодарим Консорциум X13 по кристаллографии белков за доступ к их объекту в Deutsches Elektronen-Synchrotron (DESY), Гамбург; Томас Бэйс из Института неорганической химии, Рез-у-Праги, за измерения части спектров ЯМР; и Хиллари Хоффманн за критическую вычитку рукописи.Эта работа была поддержана грантом QLK2-CT-2001-02360 из 5-й структуры Европейской комиссии и грантом Министерства образования (MSMT) Чешской Республики в рамках программы 1M6138896301 «Исследовательский центр новых противовирусных и противоопухолевых препаратов. ” В дальнейшем проект был поддержан планами исследований AVZ40550506 и AV0Z40320502 (Академия наук Чешской Республики). Синтез новых соединений частично поддерживался Исследовательским центром LC523, «Перспективные неорганические материалы» (от MSMT).

    Сноски

    • ↵ ‡ P.C., M.K., and P.Ř. внес равный вклад в эту работу.

    • †† Кому можно обращаться по адресу: Департамент аналитической химии, Институт химической технологии, Technická 5, 166 28 Прага 6, Чешская Республика. Электронная почта: vladimir.kral {at} vscht.cz. §§ Кому можно обращаться по адресу: Институт органической химии и биохимии Академии наук Чешской Республики, Flemingovo nam.2, 166 10 Прага 6, Чехия. Электронная почта: konval {at} uochb.cas.cz.

    • Вклад авторов: P.C., M.K., V.K., B.G., J. Plešek и J.K. спланированное исследование; P.C., M.K., P.Ř., J. Brynda, J. Pokorná, J. Plešek, B.G., L.D.-M., M.M., J. Bodem, H.-G.K. и V.K. проведенное исследование; P.C., Z.O., J. Plešek, B.G., L.D.-M., J. Bodem, H.-G.K. и V.K. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; P.C., M.K., P.Ř., J. Brynda, Z.O., J.S., H.-G.K., V.K. и J.K. проанализированные данные; и P.C., P.Ř., B.G., H.-G.K. и J.K. написал газету.

    • Сокращения: MIA, внутрицистернальные А-частицы мыши; PR, протеаза; ИП — ингибитор PR ВИЧ; PDB, Банк данных белков.

    • Размещение данных: координаты атомов и структурные факторы были депонированы в банке данных белков, www.rcsb.org/pdb (код PDB ID 1ZTZ).

    • Авторские права © 2005, Национальная академия наук

    Доступно бесплатно в Интернете через опцию открытого доступа PNAS.

    Кортни Торнбург | Профили RNS

  • Улучшение тестирования и приема витамина D у детей с недавно диагностированным раком: инициатива по улучшению качества в детской больнице Рэди в Сан-Диего. Педиатр Рак крови. 2021 19 июля; e29217. Шляхцисава К., Фишер Е.С., Тровиллион Э.М., Буш К., Куо Д.Дж., Ньюфилд Р.С., Торнбург CD , Робертс В., Аристизабал П.PMID: 34286891.

    Просмотр: PubMed Упоминания: Поля:
  • Оценка факторов, связанных с восприятием родителями добровольных решений об участии ребенка в клинических испытаниях лейкемии. JAMA Netw Open. 2021 03 мая; 4 (5): e219038.Аристизабал П., Ма А.К., Кумар Н.В., Пердомо Б.П., Торнбург, CD , Мартинес М.Э., Нодора Дж. PMID: 33944924.

    Просмотр: PubMed Упоминания: Поля:
  • Характеристики, осложнения и места кровотечений у младенцев и детей младше 2 лет с БВ.Blood Adv. 2021 04 27; 5 (8): 2079-2086. Dupervil B, Abe K, O’Brien SH, Oakley M, Kulkarni R, Thornburg CD , Byams VR, Soucie JM. PMID: 33877293.

    Просмотр: PubMed Упоминания: Поля: Перевод: Люди
  • Эффект полоксамера 188 по сравнению с плацебо на болезненные вазоокклюзионные эпизоды у детей и взрослых с серповидноклеточной болезнью: рандомизированное клиническое испытание.ДЖАМА. 2021 04 20; 325 (15): 1513-1523. Казелла Дж. Ф., Бартон Б. А., Кантер Дж., Блэк Л. В., Маджумдар С., Инати А., Вали Ю., Драхтман Р. А., Аббуд М. Р., Килинч И., Фух Б. Р., Аль-Хабори М. К., Такемото С. М., Салман Е., Сарнаик С. А., Шах Н., Моррис С.Р., Кейтс-Балиейро Дж., Радж А., Альварес О.А., Хсу Л.Л., Томпсон А.А., Сислер И.Ю., Пейс Б.С., Норонья С.А., Ласки Д.Л., де Джулиан Э.С., Годдер К., Торнбург CD , Камберос Н.Л., Нусс Р., Marsh AM, Owen WC, Schaefer A, Tebbi CK, Chantrain CF, Cohen DE, Karakas Z, Piccone CM, George A, Fixler JM, Singleton TC, Moulton T, Quinn CT, de Castro Lobo CL, Almomen AM, Goyal-Khemka M, Maes P, Emanuele M, Gorney RT, Padgett CS, Parsley E, Kronsberg SS, Kato GJ, Gladwin MT.PMID: 33877274.

    Просмотр в: PubMed Упоминания: Поля: Перевод: ЛюдиCTC Clinical Trials
  • Использование ресурсов здравоохранения и затраты взрослых пациентов с гемофилией А на профилактику фактора VIII: анализ административных требований.J Manag Care Spec Pharm. 2021 Март; 27 (3): 316-326. Croteau SE, Cook K, Sheikh L, Chawla A, Sammon J, Solari P, Kim B, Hinds D, Thornburg CD . PMID: 33645244.

    Просмотр: PubMed Упоминания: Поля:
  • Оценка безопасности профилактики эмицизумабом у лиц с гемофилией A.Экспертное мнение Drug Saf. 2021 Apr; 20 (4): 387-396. Ван С.П., Янг Дж., Торнбург, CD . PMID: 33612049.

    Просмотр: PubMed Упоминания: Поля: Перевод: Люди
  • Коррекция: генетические предикторы тяжелого внутрижелудочкового кровотечения у младенцев с крайне низкой массой тела при рождении.J Perinatol. 2021 фев; 41 (2): 361. Thornburg CD , Erickson SW, Page GP, Clark EAS, DeAngelis MM, Hartnett ME, Goldstein RF, Dagle JM, Murray JC, Poindexter BB, Das A, Cotten CM, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Ne. PMID: 33041330.

    Просмотр: PubMed Упоминания: Поля:
  • Переход к лечению педиатрических и взрослых пациентов с венозной тромбоэмболией: Национальный проект улучшения качества Американской сети тромбоза и гемостаза (ATHN).Thromb Res. 2021 04; 200: 23-29. ДеСанчо М., Манн Дж. Э., Биллетт Х. Х., Ченг Д., Холмс С., Джафрей Дж., Мэлоун М., Патель К., Шараткумар А., Торнбург, CD , Ван М., Уотсон К., Раджпуркар М., Исследователи исследования. PMID: 33517168.

    Просмотр: PubMed Упоминания: Поля: Перевод: Люди
  • Проблемы диагностики и лечения приобретенной гемофилии А в педиатрии: отчет о 2 случаях.J Pediatr Hematol Oncol. 2020 ноя 11. Kim KS, Wong V, Thornburg CD , Yu JC. PMID: 33181589.

    Просмотр: PubMed Упоминания: Поля:
  • Улучшение неравенства в выживаемости в педиатрической нейроонкологии в приграничном регионе США и Мексики: трансграничная инициатива между Сан-Диего, Калифорния, и Тихуаной, Мексика.JCO Glob Oncol. 2020 11; 6: 1791–1802. Аристизабал П., Бернс Л.П., Кумар Н.В., Пердомо Б.П., Ривера-Гомес Р., Орнелас М.А., Гонда Д., Малики Д., Торнбург, CD , Робертс В., Леви М.Л., Кроуфорд-младший. PMID: 33216645.

    Смотреть в: PubMed Упоминания:
  • Характеристика использования антикоагулянтов у детей с использованием набора данных Американской сети тромбоза и гемостаза (ATHNdataset).Thromb Res. 2021 01; 197: 84-87. Davila J, Cheng D, Raffini L, Thornburg CD , Corrales-Medina FF. PMID: 331.

    Просмотр: PubMed Упоминания: Поля: Перевод: Люди
  • Генетические предикторы тяжелого внутрижелудочкового кровотечения у младенцев с крайне низкой массой тела при рождении.J Perinatol. 2021 02; 41 (2): 286-294. Thornburg CD , Erickson SW, Page GP, Clark EAS, DeAngelis MM, Hartnett ME, Goldstein RF, Dagle JM, Murray JC, Poindexter BB, Das A, Cotten CM, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Ne. PMID: 32978526.

    Просмотр: PubMed Упоминания: Поля: Перевод: Люди
  • Внеклеточная тирозил-тРНК синтетаза, расщепляемая протеиназами плазмы и хранящаяся в а-гранулах тромбоцитов: потенциальная роль в активации моноцитов.Res Pract Thromb Haemost. 2020 окт; 4 (7): 1167-1177. Вон Э, Мородоми Ю., Канаджи С., Шапиро Р., Во М. Н., Орье Дж. Н., Торнбург, CD , Ян XL, Руджери З. М., Шиммель П., Канаджи Т. PMID: 33134783.

    Смотреть в: PubMed Упоминания:
  • Начало профилактики эмицизумаба у младенца с гемофилией А и субдуральным кровотечением.Гемофилия. 2020 ноя; 26 (6): e353-e355. Буш К.А., Лукас Т.Л., Хейли К.М., Торнбург, CD . PMID: 32892446.

    Просмотр: PubMed Упоминания: Поля: Перевод: Люди
  • Шансы и последствия совместного наследования гемофилии A и B.Res Pract Thromb Haemost. 2020 июл; 4 (5): 931-935. Карч С., Массер-Фрай Д., Лимжоко Дж., Райан С. Е., Флетчер С. Н., Корбетт К. Д., Йонсен Дж. М., Торнбург, CD . PMID: 32685904.

    Смотреть в: PubMed Упоминания:
  • Социально-демографические и клинические характеристики, связанные со статусом витамина D у впервые диагностированных педиатрических онкологических больных.Педиатр Гематол Онкол. 2020 Май; 37 (4): 314-325. Аристизабал П., Шерер М., Пердомо Б.П., Кастелао Е., Торнбург, CD , Праудфут Дж., Якобс Е., Ньюфилд Р.С., Заге П., Робертс В., Мартинес М.Э. PMID: 32153233.

    Просмотр в: PubMed Упоминания: 1 Сферы: Перевод: ЛюдиCTC Clinical Trials
  • Лечение и исходы детского септического тромбофлебита: серия случаев.Педиатр Гематол Онкол. 2020 Май; 37 (4): 344-352. Ку Дж, Понг А, Дори С., Фарнэс Л., Торнбург, CD . PMID: 32138584.

    Просмотр в: PubMed Упоминания: Поля: Перевод: ЛюдиCTC Clinical Trials
  • Определение будущего использования NOAC в педиатрической популяции: аналитический центр Консорциума по исследованиям сердечной безопасности.Am Heart J. 2020 06; 224: 138-147. Зельцер Дж. Х., Фаррелл А., Гольденберг Н., Хорник С., Кин Д., Крукофф М. В., Липарди С., Массикотт П., Ментцер Д., Монагл П., Торнбург С. , Ревкин Дж. Х., Уокер С., Гаджар Д. PMID: 32388153.

    Просмотр: PubMed Упоминания: Поля: Перевод: Люди
  • Оценка гематологического скрининга и периоперационного ведения пациентов с синдромом Нунана: обзор ретроспективной карты.J Pediatr. 2020 05; 220: 154-158.e6. Бриггс Б., Савла Д., Рамчандар Н., Диммок Д., Ле Д., Торнбург, CD . PMID: 32111381.

    Просмотр в: PubMed Упоминания: Поля: Перевод: ЛюдиPHPublic Health
  • Как мы подходим: обучение детских коагулянтов.Педиатр Рак крови. 2019 12; 66 (12): e27982. Thornburg CD , Montgomery RR, Pipe SW. PMID: 31486588.

    Просмотр: PubMed Упоминания: Поля: Перевод: Люди
  • Обнаружение цинги у ребенка с синдромом Якобсена: отчет о болезни.JBJS Case Connect. 2019 июль-сентябрь; 9 (3): e0352. Puddy AC, Hughes JL, Joffe AL, Khanna PC, Thornburg CD , Mubarak SJ. PMID: 31584905.

    Просмотр: PubMed Упоминания: Поля: Перевод: Люди
  • Ваши усталые, ваши бедные, ваши сбившиеся в кучу массы.Кровь. 2019 05 09; 133 (19): 2010-2011. Посуда RE, Торнбург CD . PMID: 31072964.

    Просмотр: PubMed Упоминания: Поля: Перевод: Люди
  • Региональные различия и финансовые последствия предписанных концентратов факторов продленного полураспада среди U.S. Центры лечения гемофилии для пациентов с умеренной и тяжелой гемофилией. Гемофилия. 2019 июл; 25 (4): 668-675. Croteau SE, Cheng D, Cohen AJ, Holmes CE, Malec LM, Silvey M, Thornburg CD , Wheeler AP, Kouides PA, Raffini LJ, Neufeld EJ. PMID: 30993845.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 4 поля: Перевод: Люди
  • Гематологические проявления недостаточности питания: раннее распознавание необходимо для предотвращения серьезных осложнений.J Pediatr Hematol Oncol. 2019 Apr; 41 (3): e182-e185. Ю. Дж. К., Шляхцисава К., Ван Ю. М., Пол М., Фарнес Л., Вонг В., Ким Дж., Торнбург, CD . PMID: 30339653.

    Просмотр: PubMed Упоминания: Поля: Перевод: Люди
  • Новый вариант фактора XIII, идентифицированный с помощью полногеномного секвенирования у ребенка с внутричерепным кровоизлиянием.Шпилька Cold Spring Harb Mol Case Stud. 2018 12; 4 (6). Бриггс Б., Джеймс К.Н., Чоудхури С., Торнбург С. , Фарнэс Л., Диммок Д., Кингсмор С.Ф., следователи RCIGM. PMID: 30404926.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 5 областей: Перевод: Люди
  • Новый подход к индукции иммунной толерантности при гемофилии А с помощью ингибитора фактора VIII.Гемофилия. 2019 01; 25 (1): e48-e50. Thornburg CD , Ducore J. PMID: 30468284.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 1 Сферы: Перевод: Люди
  • Венозная тромбоэмболия: исследование предпочтений пероральных антикоагулянтов в лечении сложных групп пациентов.Clin Appl Thromb Hemost. 2018 Dec; 24 (9_suppl): 209С-216С. Moyer GC, Bannow BS, Thornburg C , Rosovsky R, Wang TF, Woller S, Thornhill D, Kreuziger LB. PMID: 30278776.

    Просмотр: PubMed Упоминания: Поля: Перевод: Люди
  • Как я подхожу: ранее не леченные пациенты с тяжелой врожденной гемофилией A.Педиатр Рак крови. 2018 12; 65 (12): e27466. Торнбург CD . PMID: 30251355.

    Просмотр: PubMed Упоминания: Поля: Перевод: Люди
  • Факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний у детей и молодых людей с гемофилией.Гемофилия. 2018 сен; 24 (5): 747-754. Лимжоко Дж., Торнбург, CD . PMID: 30004151.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 2 поля: Перевод: Люди
  • Роль пациентов и медицинских работников в эпоху новых методов лечения гемофилии в развитых и развивающихся странах.Ther Adv Hematol. 2018 Авг; 9 (8): 239-249. Nossair F, Thornburg CD . PMID: 30181844.

    Смотреть в: PubMed Упоминания:
  • Идентификация и характеристика новых мутаций, связанных с врожденными нарушениями фибриногена.Res Pract Thromb Haemost. 2018 окт; 2 (4): 800-811. Смит Н., Борникова Л., Ноецли Л., Гульельмоне Х., Минольдо С., Бакос Д. С., Якобсон Л., Торнбург, CD , Эскобар М., Уайт-Адамс Т.С., Вольберг А.С., Манко-Джонсон М., Ди Паола Дж. PMID: 30349899.

    Смотреть в: PubMed Упоминания:
  • Рекомбинантный слитый белок фактора VIII Fc для индукции иммунной толерантности у пациентов с тяжелой гемофилией А с использованием ингибиторов-А ретроспективный анализ.Гемофилия. 2018 Март; 24 (2): 245-252. Каркао М., Шапиро А., Стабер Дж. М., Хванг Н., Друзгал С., Лью К, Беллетрутти М., Торнбург, CD , Ахуджа С. П., Моралес-Ариас Дж., Дюмон Дж., Миясато Дж., Цао Э, Джайн Н., Пайп С. PMID: 29436077.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 16 областей: Перевод: Люди
  • Дети с серповидно-клеточной анемией, мигрирующие в Соединенные Штаты из стран Африки к югу от Сахары.Педиатр Рак крови. 2018 06; 65 (6): e27000. Торнбург CD , ПОСУДА RE. PMID: 29418070.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 1 Сферы: Перевод: Люди
  • Соблюдение режима лечения при гемофилии. Пациенты предпочитают приверженность лечению.2017; 11: 1677-1686. Thornburg CD , Duncan NA. PMID: 255.

    Смотреть в: PubMed Упоминания:
  • Новая сложная гетерозиготная форма тяжелого дефицита протеина С, вызывающая кровотечение без молниеносной пурпуры.Педиатр Рак крови. 2017 11; 64 (11). Херрик Н.Л., Геддис А.Е., Лавджой А.Е., Ким Дж., Шифф Д., Торнбург, CD . PMID: 28485122.

    Просмотр: PubMed Упоминания: Поля: Перевод: Люди
  • Венозная тромбоэмболия у детей с онкологическими заболеваниями и заболеваниями крови.Фронт Педиатр. 2017; 5:12. Ko RH, Thornburg CD . PMID: 28220143.

    Смотреть в: PubMed Упоминания:
  • Атаксия, телеангиэктазия, проявляющаяся в виде синдрома гипер-IgM без неврологических симптомов. Ann Allergy Asthma Immunol.2016 09; 117 (3): 221-6. Доши А., Рю Дж., Торнбург, CD , Херши Д., Черри Р., Миллиган К., Розенцвейг С., Леонард С. PMID: 27613453.

    Просмотр: PubMed Упоминания: Поля: Перевод: Люди
  • Первоначальная оценка доменов здоровья PROMIS® в педиатрии у детей и подростков с серповидно-клеточной анемией.Педиатр Рак крови. 2016 июн; 63 (6): 1031-7. Дампир С., Барри В., Гросс Х.Э., Луи У., Торнбург, CD , ДеУолт Д.А., Рив ВВ. PMID: 26895143.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 26 областей: Перевод: Люди
  • Эффекты лечения гидроксимочевиной у пациентов с гемоглобиновой болезнью СК.Am J Hematol. 2016 фев; 91 (2): 238-42. Лучтман-Джонс Л., Прессел С., Хиллиард Л., Браун Р.С., Смит М.Г., Томпсон А.А., Ли М.Т., Ротман Дж., Роджерс З.Р., Оуэн В., Имран Х., Торнбург С , Квятковски Д.Л., Айгун Б., Нельсон С., Робертс C, Gauger C, Piccone C, Kalfa T, Alvarez O, Hassell K, Davis BR, Ware RE. PMID: 26615793.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 15 областей: Перевод: Люди
  • Усталость у детей с серповидноклеточной болезнью: связь с нейрокогнитивным и социально-эмоциональным функционированием и качеством жизни.J Pediatr Hematol Oncol. 2015 ноя; 37 (8): 584-9. Андерсон Л.М., Аллен TM, Торнбург, CD , Боннер М.Дж. PMID: 26479993.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 6 областей: Перевод: Люди
  • Гематологические результаты после тотальной спленэктомии и частичной спленэктомии по поводу врожденной гемолитической анемии.J Pediatr Surg. 2016 Янв; 51 (1): 122-7. Englum BR, Rothman J, Leonard S, Reiter A, Thornburg C , Brindle M, Wright N, Heeney MM, Jason Smithers C, Brown RL, Kalfa T, Langer JC, Cada M, Oldham KT, Scott JP, St Peter С.Д., Шарма М., Давидофф А.М., Коттедж К., Бернабе К., Уилсон Д.Б., Датта С., Глэдер Б., Крари С.Е., Дассинджер М.С., Данбар Л., Ислам С., Кумар М., Рескорла Ф, Брух С., Кэмпбелл А., Остин М., Сидонио Р., Блейкли М.Л., Райс Х.Э., Консорциум спленэктомии при врожденной гемолитической анемии.PMID: 26613837.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 10 областей: Перевод: Люди
  • Фармакокинетика и биоэквивалентность жидкого препарата гидроксимочевины у детей с серповидно-клеточной анемией. J Clin Pharmacol. 2016 Март; 56 (3): 298-306.Эстепп Дж. Х., Меллони С., Торнбург CD , Викзлинг П., Роджерс З., Ротман Дж. А., Грин Н. С., Лием Р., Брэндоу А. М., Crary SE, Ховард Т. Х., Моррис М. Х., Левандовски А., Гарг Ю., Юско В. Дж., Невилл К. А., Закон о лучших лекарствах для детей — основной административный комитет сети педиатрических испытаний. PMID: 26201504.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 5 областей: Перевод: ЛюдиCTC Clinical Trials
  • Врожденный гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз, проявляющийся у новорожденного в виде тромбоцитопении.J Pediatr Hematol Oncol. 2015 Май; 37 (4): 300-3. Хинсон А., Оуэн В., Проза Н., Парих С., Торнбург С. . PMID: 25121636.

    Просмотр: PubMed Упоминания: Поля: Перевод: Люди
  • От младенчества до подросткового возраста: пятнадцать лет непрерывного лечения гидроксимочевиной при серповидно-клеточной анемии.Медицина (Балтимор). 2014 Dec; 93 (28): e215. Hankins JS, Aygun B, Nottage K, Thornburg C , Smeltzer MP, Ware RE, Wang WC. PMID: 25526439.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 18 областей: Перевод: Люди
  • Клинические результаты спленэктомии у детей: отчет о спленэктомии в регистре врожденной гемолитической анемии.Am J Hematol. 2015 Март; 90 (3): 187-92. Райс Х. Э., Энглум Б. Р., Ротман Дж., Леонард С., Райтер А., Торнбург С. , Тигровый М, Райт Н., Хини М. М., Смитерс С., Браун Р. Л., Калфа Т., Лангер Дж. К., Када М., Олдхэм К. Т., Скотт Дж. П., Сент-Питер С., Шарма М., Давидофф А. М., Коттедж К., Бернабе К., Уилсон Д. Б., Датта С., Глэдер Б., Крари С. Е., Дассинджер М. С., Данбар Л., Ислам С., Кумар М., Рескорла Ф, Брух С., Кэмпбелл А., Остин М., Сидонио Р., Блейкли М.Л., Консорциум спленэктомии при врожденной гемолитической анемии (SICHA).PMID: 25382665.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 6 областей: Перевод: HumansCells
  • Госпитальная венозная тромбоэмболия у детей: призыв к действию. J Pediatr. 2014 Октябрь; 165 (4): 652-3. Махаджерин А, Торнбург, CD .PMID: 25108540.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 1 Сферы: Перевод: Люди
  • Путешественники с серповидно-клеточной анемией. J Travel Med. 2014 сентябрь-октябрь; 21 (5): 332-9. Willen SM, Thornburg CD , Lantos PM.PMID: 24947546.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 4 поля: Перевод: HumansPHPublic Health
  • Препятствуют ли трудности с глотанием лекарства применению гидроксимочевины у детей? Педиатр Рак крови. 2014 сен; 61 (9): 1536-9. Bekele E, Thornburg CD , Brandow AM, Sharma M, Smaldone AM, Jin Z, Green NS.PMID: 24753149.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 4 поля: Перевод: Люди
  • Серповидно-клеточная анемия: время для индивидуального назначения гидроксимочевины? Сосредоточьтесь на «Органические переносчики анионов полипептида 1B модулируют фармакокинетику гидроксимочевины».. 2013 Dec 15; 305 (12): C1209-10. Торнбург CD . PMID: 24005044.

    Смотреть в: PubMed Упоминания:
  • Двухлетняя девочка с ко-наследственным муковисцидозом и серповидно-клеточной талассемией с рецидивирующими вазоокклюзионными явлениями во время обострений кистозного фиброза легких: отчет о клиническом случае.J Med Case Rep. 26 июля 2013 г .; 7: 203. Собуш К.Т., Торнбург CD , Войнов Д.А., Дэвис С.Д., Петерсон-Кармайкл С.Л. PMID: 238.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 1 Поля:
  • Анализ сцепления идентифицирует локус плазменного фактора фон Виллебранда, не обнаруженный ассоциацией по всему геному.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2013, 08 января; 110 (2): 588-93. Desch KC, Ozel AB, Siemieniak D, Kalish Y, Shavit JA, Thornburg CD , Sharathkumar AA, McHugh CP, Laurie CC, Crenshaw A, Mirel DB, Kim Y, Cropp CD, Molloy AM, Kirke PN, Bailey-Wilson Дж. Э., Уилсон А. Ф., Миллс Дж. Л., Скотт Дж. М., Броуди Л. С., Ли Дж. З., Гинзбург Д. PMID: 23267103.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 40 областей: Перевод: HumansCells
  • Отчет о молодой девушке с мутацией MYH9 и обзор литературы.J Pediatr Hematol Oncol. 2012 окт; 34 (7): 538-40. Ланди Д., Локхарт Э., Миллер С.Е., Датто М., Редер С., Канали А, Торнбург, CD . PMID: 23007341.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 1 Сферы: Перевод: Люди
  • Тенденции госпитализаций по поводу венозной тромбоэмболии, 1994-2009 гг.Педиатрия. 2012 окт; 130 (4): e812-20. Boulet SL, Grosse SD, Thornburg CD , Yusuf H, Tsai J, Hooper WC. PMID: 22987875.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 15 областей: Перевод: Люди
  • Характеристика состояния гиперкоагуляции у пациентов с серповидно-клеточной анемией.Thromb Res. 2012 ноя; 130 (5): e241-5. Shah N, Thornburg C , Telen MJ, Ortel TL. PMID: 22959127.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 10 областей: Перевод: Люди
  • Транслокация микроРНК серповидноклеточных эритроцитов в Plasmodium falciparum ингибирует трансляцию паразитов и способствует устойчивости к малярии.. 2012 16 августа; 12 (2): 187-99. Ламонте Дж., Филип Н., Рирдон Дж., Лаксина Дж. Р., Майорос В., Чапман Л., Торнбург, CD , Телен М. Дж., Олер Ю., Никчитта К. В., Хейстед Т., Чи Дж. Т.. PMID: 229.

    Смотреть в: PubMed Упоминания:
  • Риск кровотечения выше у детей по сравнению со взрослыми, получающими профилактическое переливание тромбоцитов по поводу вызванной лечением гипопролиферативной тромбоцитопении.Кровь. 2012 г. 26 июля; 120 (4): 748-60. Джозефсон С.Д., Грейнджер С., Ассманн С.Ф., Кастильехо М.И., Штраус Р.Г., Слихтер С.Дж., Штайнер М.Э., Journeycake JM, Торнбург, CD , Бассель Дж., Грабовски Е.Ф., Нойфельд Е.Д., Сэвидж В., Слоан С.Р. PMID: 22538854.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 15 областей: Перевод: Люди
  • Текущее назначение инфузий профилактических факторов и предполагаемая приверженность детям и подросткам с гемофилией: опрос медицинских работников, занимающихся гемофилией в Соединенных Штатах.Гемофилия. 2012 июл; 18 (4): 568-74. Thornburg CD , Carpenter S, Zappa S, Munn J, Leissinger C. PMID: 22335526.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 9 областей: Перевод: Люди
  • Тяжелая гемолитическая анемия плода и новорожденного из-за делеции 198 т.п.н., удаляющей полный кластер бета-глобина.Педиатр Рак крови. 2012 ноя; 59 (5): 941-4. Верховсек М., Шах Н.Р., Уилкокс И., Кениг С.К., Баррос Т., Торнбург, CD , Штейнберг М.Х., Луо Х.Й., Чуйский DH. PMID: 22294483.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 1 Сферы: Перевод: Люди
  • Влияние лечения гидроксимочевиной на параметры функции почек: результаты многоцентрового плацебо-контролируемого клинического исследования BABY HUG у младенцев с серповидно-клеточной анемией.Педиатр Рак крови. 2012 окт; 59 (4): 668-74. Альварес О., Миллер С.Т., Ван В.К., Луо З., Маккарвилл М.Б., Шварц Г.Дж., Томпсон Б., Ховард Т., Айер Р.В., Рана С.Р., Роджерс З.Р., Сарнаик С.А., Торнбург, CD , Ware RE, BABY HUG Investigators. PMID: 22294512.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 35 областей: Перевод: ЛюдиCTC Клинические испытания
  • Оценка частичной и полной спленэктомии у детей с серповидно-клеточной анемией с использованием реестра в Интернете.Педиатр Рак крови. 2012 15 июля; 59 (1): 100-4. Mouttalib S, Rice HE, Снайдер D, Levens JS, Reiter A, Soler P, Rothman JA, Thornburg CD . PMID: 22238140.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 6 областей: Перевод: ЛюдиCTC Клинические испытания
  • Осложнения имплантируемых устройств венозного доступа у пациентов с серповидно-клеточной анемией.Am J Hematol. 2012 фев; 87 (2): 224-6. Шах Н., Ланди Д., Шах Р., Ротман Дж., Де Кастро Л. М., Торнбург, CD . PMID: 22081438.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 3 поля: Перевод: HumansAnimalsCells
  • Влияние гидроксимочевины на периоперационное ведение и исходы у детей с серповидно-клеточной анемией.J Pediatr Hematol Oncol. 2011 Октябрь; 33 (7): 487-90. Хаяши М., Калатрони А., Херцберг Б., Росс А. К., Райс Х. Э., Торнбург С. . PMID: 21941139.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 2 поля: Перевод: Люди
  • Взросление с серповидно-клеточной анемией: пилотное исследование переходной программы для подростков с серповидно-клеточной анемией.J Pediatr Hematol Oncol. 2011 июл; 33 (5): 379-82. Смит GM, Льюис В.Р., Уитворт E, Gold DT, Thornburg CD . PMID: 21602723.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 11 областей: Перевод: Люди
  • Ответ на стероиды предсказывает ответ на ритуксимаб при хронической иммунной тромбоцитопении у детей.Педиатр Рак крови. 2012 фев; 58 (2): 221-5. Грейс Р.Ф., Беннетт CM, Ричи А.К., Дженг М., Торнбург, CD , Ламберт М.П., ​​Нейер М., Рехт М., Кумар М., Бланшетт В., Клаассен Р.Дж., Бьюкенен Г.Р., Курт М.Х., Ньюджент Д.Д., Томпсон А.А., Стайн К. Калиш Л.А., Нойфельд Э.Дж. PMID: 21674758.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 12 областей: Перевод: Люди
  • Этические соображения для фармакогеномного тестирования в педиатрической клинической помощи и исследованиях.Фармакогеномика. 2011 июн; 12 (6): 889-95. Moran C, Thornburg CD , Barfield RC. PMID: 21692618.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 5 областей: Перевод: ЛюдиЖивотные
  • Гидроксикарбамид у детей раннего возраста с серповидноклеточной анемией: многоцентровое рандомизированное контролируемое исследование (BABY HUG).Ланцет. 2011 14 мая; 377 (9778): 1663-72. Wang WC, Ware RE, Miller ST, Iyer RV, Casella JF, Minniti CP, Rana S, Thornburg CD , Rogers ZR, Kalpatthi RV, Barredo JC, Brown RC, Sarnaik SA, Howard TH, Wynn LW, Kutlar A, Armstrong FD, Files BA, Goldsmith JC, Waclawiw MA, Huang X, Thompson BW, исследователи BABY HUG. PMID: 21571150.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 212 Областей: Перевод: Люди
  • Различия в качестве жизни, связанном со здоровьем, у детей с серповидно-клеточной анемией, получающих гидроксимочевину.J Pediatr Hematol Oncol. 2011 May; 33 (4): 251-4. Thornburg CD , Calatroni A, Panepinto JA. PMID: 21516020.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 33 Области: Перевод: Люди
  • Долгосрочные результаты применения гидроксимочевины / флеботомии для снижения вторичного риска инсульта у детей с серповидно-клеточной анемией и перегрузкой железом.Am J Hematol. 2011 Apr; 86 (4): 357-61. Greenway A, Ware RE, Thornburg CD . PMID: 21442640.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 12 областей: Перевод: ЛюдиPHPHPublic Health
  • Лечение рекомбинантным активированным фактором VIIa при рефрактерном кровотечении у младенцев.J Perinatol. 2011 Март; 31 (3): 188-92. Данг С.Н., Катакам Л.И., Смит П.Б., Коттен С.М., Голдберг Р.Н., Чандлер Н., Торнбург, CD , Бидегейн М. PMID: 20671714.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 2 поля: Перевод: Люди
  • Транскраниальная допплерография у младенцев с серповидно-клеточной анемией: исходные данные исследования BABY HUG.Педиатр Рак крови. 2010 фев; 54 (2): 256-9. Павлакис С.Г., Рис Р.С., Хуанг X, Браун Р.С., Казелла Дж.Ф., Айер Р.В., Калпатти Р., Люден Дж., Миллер С.Т., Роджерс З.Р., Торнбург, CD , Ван В.С., Адамс Р.Дж., BABY HUG Investigators. PMID: 19813252.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 15 областей: Перевод: Люди
  • Клиническое исследование фазы III гидроксимочевины у детей (BABY HUG): проблемы дизайна исследования.Педиатр Рак крови. 2010 фев; 54 (2): 250-5. Thompson BW, Miller ST, Rogers ZR, Rees RC, Ware RE, Waclawiw MA, Iyer RV, Casella JF, Luchtman-Jones L, Rana S, Thornburg CD , Kalpatthi RV, Barredo JC, Brown RC, Sarnaik S, Howard TH, Удача L, Ван WC. PMID: 19731330.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 25 областей: Перевод: Люди
  • Приверженность к изучаемым препаратам и посещения: данные исследования BABY HUG.Педиатр Рак крови. 2010 фев; 54 (2): 260-4. Thornburg CD , Rogers ZR, Jeng MR, Rana SR, Iyer RV, Faughnan L, Hassen L, Marshall J, McDonald RP, Wang WC, Huang X, Rees RC, BABY HUG Investigators. PMID: 19856395.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 18 областей: Перевод: Люди
  • Педиатрическая практика варфарина и фармакогенетическое тестирование.Thromb Res. 2010 Aug; 126 (2): e144-6. Thornburg CD , Jones E, Bomgaars L, Gage BF. PMID: 20097410.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 2 поля: Перевод: Люди
  • Устойчивое истощение антител после ритуксимаба у трех детей с аутоиммунными цитопениями.Педиатр Гематол Онкол. 2009 ноя; 26 (8): 566-72. Adeli MM, Eichner BH, Thornburg C , Williams L. PMID: 19954366.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 3 поля: Перевод: HumansCells
  • Приверженность к терапии гидроксимочевиной у детей с серповидно-клеточной анемией.J Pediatr. 2010 Март; 156 (3): 415-9. Thornburg CD , Calatroni A, Telen M, Kemper AR. PMID: 19880135.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 47 Сферы: Перевод: Люди
  • Тестирование детей на наследственную тромбофилию: больше вопросов, чем ответов.Br J Haematol. 2009 ноя; 147 (3): 277-88. Раффини Л., Торнбург С . PMID: 19656153.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 10 областей: Перевод: Люди
  • Пилотное исследование гидроксимочевины для предотвращения хронического поражения органов у маленьких детей с серповидно-клеточной анемией.Педиатр Рак крови. 2009 May; 52 (5): 609-15. Thornburg CD , Dixon N, Burgett S, Mortier NA, Schultz WH, Zimmerman SA, Bonner M, Hardy KK, Calatroni A, Ware RE. PMID: 1

    13.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 36 областей: Перевод: ЛюдиCTC Клинические испытания
  • Заболевание гемоглобином SE в штате Мэн и тяжелая талассемия в Нью-Гэмпшире.J Pediatr Hematol Oncol. 2009 Apr; 31 (4): 307. Thornburg CD , Steinberg MH, Chui DH. PMID: 19346889.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 3 области: Перевод: Люди
  • Связано ли увеличенное время пребывания периферически введенного катетера с повышенным риском инфекции кровотока у младенцев? Инфекционный контроль Hosp Epidemiol.2008 Aug; 29 (8): 749-53. Смит П.Б., Бенджамин Д.К., Коттен С.М., Шульц Э., Гуо Р., Новелл Л., Смитвик М.Л., Торнбург, CD . PMID: 18582196.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 5 областей: Перевод: Люди
  • Частичная спленэктомия у детей с врожденной гемолитической анемией и массивной спленомегалией.J Pediatr Surg. 2008 Mar; 43 (3): 466-72. Diesen DL, Zimmerman SA, Thornburg CD , Ware RE, Skinner M, Oldham KT, Rice HE. PMID: 18358283.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 4 поля: Перевод: Люди
  • Периоперационная замена фактора IX при хирургической резекции супраселлярной астроцитомы у ребенка с тяжелой гемофилией B.Гемофилия. 2008 Mar; 14 (2): 387-9. Уокер Дж. А., Диксон Н., Гуруранган С., Торнбург С. . PMID: 18194312.

    Просмотр: PubMed Упоминания: Поля: Перевод: Люди
  • Восприятие врачами приверженности профилактическим вливаниям фактора свертывания крови.Гемофилия. 2008 Янв; 14 (1): 25-9. Торнбург CD . PMID: 18028395.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 11 областей: Перевод: Люди
  • Связь между тромбозом и инфекцией кровотока у новорожденных с периферическими катетерами.Thromb Res. 2008; 122 (6): 782-5. Thornburg CD , Smith PB, Smithwick ML, Cotten CM, Benjamin DK. PMID: 17997477.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 5 областей: Перевод: Люди
  • Скрининг на тромбофилию у бессимптомных детей.Thromb Res. 2008; 121 (5): 597-604. Thornburg CD , Dixon N, Paulyson-Nuñez K, Ortel T. PMID: 17631949.

    Просмотр: PubMed Упоминания: Поля: Перевод: Люди
  • Тяжелая недостаточность фактора V, проявляющаяся внутричерепным кровотечением во время беременности.Гемофилия. 2007 июл; 13 (4): 432-4. Ellestad SC, Zimmerman SA, Thornburg C , Mitchell TE, Swamy GK, James AH. PMID: 17610562.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 2 поля: Перевод: Люди
  • Неонатальные тромбоэмболические неотложные состояния.Semin Fetal Neonatal Med. 2006 июн; 11 (3): 198-206. Торнбург C , Пайп С. PMID: 16520103.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 7 областей: Перевод: Люди
  • Соблюдение профилактических инфузий фактора VIII или фактора IX при гемофилии.Гемофилия. 2006 Mar; 12 (2): 198-9. Thornburg CD , Труба SW. PMID: 16476098.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 8 областей: Перевод: Люди
  • Хирургическая резекция меланомы у детей высокого риска и адъювантная терапия интерфероном.Педиатр Рак крови. 2005 May; 44 (5): 441-8. Чао М.М., Шварц Дж.Л., Векслер Д.С., Торнбург, CD , Гриффит К.А., Уильямс Дж. А. PMID: 15468307.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 5 областей: Перевод: Люди
  • Лимфома Беркитта и синдром Вильямса: модель для детей с мультисистемным расстройством и злокачественными новообразованиями.J Pediatr Hematol Oncol. 2005 Feb; 27 (2): 109-11. Thornburg CD , Roulston D, Castle VP. PMID: 15701989.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 8 областей: Перевод: Люди
  • Опухоли грудного нервного гребня при синдроме Беквита-Видеманна.Med Pediatr Oncol. 2003 ноя; 41 (5): 468-9. Thornburg CD , Shulkin BL, Castle VP, McAllister-Lucas LM. PMID: 14515390.

    Просмотр: PubMed Упоминания: Поля: Перевод: Люди
  • Тромб трехстворчатого клапана и эмбол легочной артерии у младенца с гомозиготным термолабильным метилентетрагидрофолатредуктазой и гетерозиготным вариантом протромбина G20210A.J Perinatol. 2003 Sep; 23 (6): 513-5. Thornburg CD , Lattimore KA, Pipe SW. PMID: 13679943.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 1 Сферы: Перевод: Люди
  • Полезность теста на аутогемолиз для детей с врожденной гемолитической анемией.Clin Lab Haematol. 2003 Feb; 25 (1): 25-8. Торнбург CD , ПОСУДА RE. PMID: 12542438.

    Просмотр: PubMed Упоминания: Поля: Перевод: Люди
  • Младенец с гомозиготным гемоглобином D-Иран.J Pediatr Hematol Oncol. 2001 Jan; 23 (1): 67-8. Thornburg CD , Zimmerman SA, Schultz WH, Ware RE. PMID: 11196276.

    Просмотр: PubMed Упоминания: 2 поля: Перевод: HumansCells
  • Rapparees-Starlights GAA Club | Facebook

    БОСС АЛАН ВЗДРАВЛЯЕТСЯ ДЛЯ МЛАДШИХ ФУТБОЛЕРОВ В преддверии этих выходных. Открытие чемпионата против ЛАОИСа:

    . Как ни важно, воскресенье для их коллег по футболу, с первым матчем чемпионата против Уиклоу, оно также имеет значение для мелких футболистов Уэксфорда, поскольку они готовятся. сразиться с Лаоисом 26 июня.

    «На этой неделе нам предстоит сделать несколько жестких звонков, поскольку мы планируем завершить наши стартовые 15 и состав из 24 на матч», — сообщает младший босс Алан Моллой, когда человек из Каслтауна и его закулисная команда достигают дня «Д».

    Алан фактически берет бразды правления в свои руки, будучи в прошлом году тренером и тренером Дэвида Мерфи (Сент-Мэрис Росслэр), который сейчас отвечает за футболистов округа до 20 лет.

    «Мы играем на лаойском языке. Они были полуфиналистами в Ленстере в течение последних двух лет, и мы знаем, что в Лао их высоко ценят.У них очень конкурентоспособная и хорошо организованная команда; мы знаем, что перед нами », — добавляет Алан.

    Но он быстро поверил в то, что молодежь гонится за футболкой Уэксфорда.

    «Я всегда сосредотачивался только на нашей команде. Моя философия всегда заключалась в подходе, ориентированном на игроков, и создании среды и культуры, которые позволяют игрокам преуспевать и добиваться результатов. У нас есть очень талантливые футболисты, которые продемонстрировали отличную трудовую этику и отношение на протяжении всего времени, проведенного вместе ».

    « Если мы сможем заставить их раскрыть свой потенциал и улучшить их индивидуально и коллективно, то это будет шагом в правильном направлении. .

    Менеджер собрал впечатляющую закулисную команду, в которую вошли основные тренеры Кейт О’Хара (HWH-Bunclody), Майкл Куинн (Каслтаун), Брайан Далтон (Наом Ианна) и Брендан Халпин (Каслтаун). Тренер вратарей — Майкл О’Тул, ранее работавший в Starlights, а теперь — в St. Peter’s Dunboyne в Мите. Тем временем Барри Лейси (Oulart-The Ballagh) наблюдает за силой и подготовкой, а его коллеги из Каслтауна Брайан Карти и Джеймс Флуд эффективно обрабатывают статистику и анализ игровых дней.
    «Я хотел собрать серьезную тренерскую и закулисную команду, которая могла бы соперничать с любой другой второстепенной организацией по всей стране», — подчеркивает человек, который рад, что его постоянное участие также служит обеспечению преемственности в руководстве. команда.

    «На мой взгляд, это было естественное развитие. Я работал ведущим тренером с Дэвидом (Мерфи) в течение последних трех лет — до 15, до 16 и несовершеннолетних — и я хотел получить шанс стать менеджером. Я очень рад получить эту возможность, и я взволнован и надеюсь на предстоящий сезон, действительно с нетерпением жду испытания, которое Лаойс бросит 26 июня.

    «Прошлого больше нет, будущее не написано, но прямо здесь, прямо сейчас я твердо верю, что футбол Уэксфорда движется в правильном направлении».

    2021 Wexford Minor Football Панель:
    Сзади (слева направо): 11. Катал Мерфи (Сент-Эннс), 20. Шон Хьюз (Баллинастраг Гэлс), 33. Циан Хьюз (Баллинастраг Гэлс), 6. Мосси Митен ( Наом Ианна), 14. Майкл МакГонигл (Баллинастраг Гэлс), скрытый Г. К. Дарби Перселл (Сарсфилдс), 2. Колин Кавана (Сент-Патрикс), 32.Эоин Уилан (Фетхард), 31 год. Джек Моррис (Маршалстаун-Кастлдокрелл).

    Второй ряд (слева направо):, затемнен 21-м лицом впереди Бен Кавана (Сент-Патрикс), 26. Даниэль Ормонд (Шелмальерс), 3. Джеймс Дойл (Глинн Барнтаун), 23. Киллиан Туми (Сарсфилдс), 13 Пол Уолш (Сент-Джеймс), 35. Джо Девлин (Банноу-Баллимитти), скрытый голкипером Пайди Пауэр (Сент-Эннс), 8 (скрытый 7) Эндрю Смит (Баллинастраг Гэлс-капитан), 15. Джеймс МакГрейнор ( Наом Эанна), 22. Руари Мартин (Наом Эанна).

    Третий ряд (слева направо): 29. Тадг Хейс (Сент-Мэри-Росслэр), 10. Брендан Болджер (Ballynastragh Gaels), 17. Катал Мерфи (Ballynastragh Gaels), 18. Дин Кехо (Адамстаун), 7. Дилан. Кук Леонард (Наом Эанна), 30 лет. Конор Келли (Наом Ианна — вице-капитан), 19 лет. Джек Хеннесси (Ойлгейт-Гленбрайен).

    В первом ряду (слева направо): 34. Эоин Бланчфилд (Баллинастраг Гэлз), 21. Кайл Рэнкин (Сент-Финтан), 24. Дэниел Болджер (Баллинастрах Гаэльс), 1. Пол Бернс (Ойлгейт-Гленбрайен), 16.Эоин Халлиган (Сарсфилдс), 4. Бен Росситер (Монагир-Булавог), Джейдн Чиверс (Сент-Джеймс).

    2021 Wexford Minor Football Management:
    Брайан Карти (Каслтаун), Брайан Далтон (Наом Ианна), Джеймс Флуд (Каслтаун), Барри Лейси (Уларт Баллах), Алан Моллой (Каслтаун, менеджер), Мик О’Тул (Starlights ), Брендан Халпин (Каслтаун), Кейт О’Хара (HWH Bunclody). На фотографии отсутствует Майкл Куинн (Каслтаун).

    станки для фазового шлифования

    Редкоземельные элементы: обзор производства, обработки

    Редкоземельные элементы: обзор производства, обработки, переработки и до 0.5 процентов РЗЭ или больше — Обогащение = Измельчение, флотация, сгущение, разделение, сушка — Экстракция жидкость-жидкость, экстракция твердое вещество-жидкость, твердая фаза, ионный обмен, сверхкритическая экстракция, электрохимическое извлечение, электрорафинирование или электрошлак

    Получить цену

    Olde Tyme Мельница для производства арахисового масла и миндального масла для измельчения кешью

    Olde Tyme Nut Grinder 110-220 В / 60 Гц. Примечание по поставке: мы доставляем измельчители орехового масла Olde Tyme, а Olde Tyme отсутствует на складе измельчителя из нержавеющей стали 220 В.Они ожидают, что в середине сентября их будет больше. Измельчитель Olde Tyme производит пастообразную ореховую пасту из арахиса, кешью, миндаля, фисташек и многого другого.

    Получить цену

    Редкоземельные элементы: обзор производства, переработки

    Редкоземельные элементы: обзор производства, переработки, переработки и до 0,5% РЗЭ или более — Обогащение = измельчение, флотация, сгущение, разделение, сушка твердого вещества фаза, ионный обмен, сверхкритическая экстракция, электровыделение, электрорафинирование или электрошлаковое рафинирование — Уменьшение = для редкоземельных сплавов высокой чистоты

    Получить цену

    Оптимальная конструкция новой тройки

    Таким образом, в данной статье обсуждается новый высокоэффективный -скоростная модульная конструкция с четырьмя зубьями на роторе.Рис. 1. Геометрия машины обращения потока (FRM) согласно [1] (a) и согласно [3 b). В этой статье, чтобы преодолеть вышеупомянутые недостатки однофазного FRM, показанного в

    Get Price

    Shop Tools and Machinery at Grizzly

    Grizzly Industrial, Inc. является национальной розничной и интернет-компанией, предоставляющей широкий спектр высококачественных услуг. качественное деревообрабатывающее и металлообрабатывающее оборудование, электроинструмент, ручной инструмент и аксессуары. Продавая напрямую конечным пользователям, мы обеспечиваем профессионалов и любителей продуктов самого высокого качества по лучшей цене.

    Получить цену

    Bridgeport Machine Rebuilders

    Такова была философия бизнеса Руди Банноу и его партнера Магнуса Вальстрома, основателей компании Bridgeport Machine Company. Именно благодаря простоте и практике этой философии мельница Бриджпорт перешла в 21 век. Группа по ремонту станков, подразделение STK Rebuilders, Inc., практикует и следит за этим

    Get Price

    Three

    Трехфазная электроэнергия является распространенным методом производства, передачи и распределения электроэнергии переменного тока.Это разновидность многофазной системы, которая является наиболее распространенным методом передачи энергии в электрических сетях во всем мире. Он также используется для питания больших двигателей и других тяжелых нагрузок. Трехпроводная трехфазная схема обычно более экономична, чем эквивалентная двухпроводная.

    Получить цену

    Практик-машинист

    28 июня 2021 г. Крупнейший в мире машинист, ЧПУ и производство Форум. За последний год у Practical Machinist более 10,6 миллионов уникальных посетителей. Получить цену

    Деревообрабатывающие станки Деревообрабатывающее оборудование

    Просмотрите и сравните полную линейку деревообрабатывающего оборудования JET, ленточные пилы, настольные пилы, токарные станки, шлифовальные станки, фуганки, строгальные станки, сверла прессы, пылеуловители и др.Начните делать покупки в Интернете для деревообрабатывающих станков и деревообрабатывающих инструментов или найдите ближайший к вам выставочный зал.

    Получить цену

    Применение стандарта Lockout / Tagout для штампа

    28 декабря 2006 г. Что касается замены шлифовального круга на плоскошлифовальном станке, то смена круга происходит вне обычного производственного процесса: т. Е. Машина выключается, операции шлифования прекращаются, кожух снимается, стопорная гайка круга откручивается и снимается.

    Получить цену

    Эффект редкости

    Мы изменили содержание редкоземельных элементов (РЗЭ) в порошковой проволоке, используемой для сварки высокопрочных низколегированных сталей (HSLA).Исследовано влияние добавления РЗЭ на микроструктуру, а также на механические и электрохимические свойства свариваемого металла (СМ). Сварные металлы, модифицированные РЗЭ, показывают очень разные отклики во время спектроскопии электрохимического импеданса.

    Get Price

    ICP

    Обработка образцов методом ICP-MS. В большинстве рутинных анализов ICP-MS образец вводится в виде жидкости с помощью распылителя и распылительной камеры. Распылитель использует сверхзвуковое расширение газа, чтобы превратить жидкость в мелкодисперсный туман, а затем распылительная камера удаляет все капли.

    Узнать цену

    SKIL 3380

    SKIL 3380-01 6-дюймовая настольная шлифовальная машина с подсветкой.Настольную шлифовальную машину 3380 с подсветкой можно найти во всех сферах применения в домашней мастерской или гараже. Гладкие шероховатые кромки зубил, сверл и ножей. Зачистить сварные соединения и заклепки или отполировать поверхности. Эта кофемолка с двигателем на 2,1 А оснащена колесами среднего и крупного помола.

    Получить цену

    Amazon: преобразователь одной фазы в 3 фазы

    Преобразователь одной фазы в 3 фазы

    , MY-PS-10, лучший для двигателя мощностью 7,5 л.с. (5,5 кВт), 23 А, 200–240 В, следует использовать только для одного двигателя на Один DPS, вход / выход 200-240 В.3,9 из 5 звезд. 43. $ 285,00. 285 долларов. . 00. Получите его, как только в четверг, 1 июля. БЕСПЛАТНАЯ доставка по Amazon.

    Получить цену

    Шлифовальный станок Masala

    Характеристики: — Корпус и шлифовальный барабан из нержавеющей стали, сверхмощный редуктор, сверхмощный шлифовальный камень и скребок для кокоса. Технические характеристики: — ГАЗОВАЯ СИСТЕМА ПУНКТ МОДЕЛЬ ОБЩИЙ РАЗМЕР ЭЛЕКТРИЧЕСКАЯ НАГРУЗКА Объем 3 л JON / WMG — 3 23 ″ LX 16 ″ WX (10 + 16) «H 1/2 л.с., однофазный Объем 5 л JON / WMG — []

    Узнать цену

    Системы для шлифовки и полировки полов и алмазные инструменты

    Подготовка, шлифовка и полировка бетонных полов, а также ремонт и полировка терраццо и другого природного камня — сложная работа.Чтобы стать успешным профессиональным оператором, вам необходимо уникальное сочетание навыков, физической силы и хорошо развитого чувства к материалу, над которым вы работаете, с четким представлением о результате, которого вы добьетесь.

    Получить цену

    Мельница для орехов Olde Tyme и миндального масла с кешью

    Мельница для орехов Olde Tyme 110-220 В / 60 Гц. Примечание по поставке: мы доставляем измельчители орехового масла Olde Tyme, а Olde Tyme отсутствует на складе измельчителя из нержавеющей стали 220 В. Они ожидают, что в середине сентября их будет больше.Измельчитель Olde Tyme производит пастообразную ореховую пасту из арахиса, кешью, миндаля, фисташек и многого другого.

    Получить цену

    Оборудование для восстановления двигателей

    Joe Baker Equipment Sales, Inc. — один из крупнейших дилеров оборудования для восстановления двигателей в США. Мы специализируемся на оборудовании для восстановления двигателей Berco, обслуживании запчастей, оборудовании для восстановления двигателей Comec, головном оборудовании Winfield

    Получить цену

    ObjectiveBooks

    Викторина Компьютерные науки Engg CS Пробный тест — L 1 CS Пробный тест — L 2 Дизайн Дополнительная электронная книга Заработайте BTC Пробный тест EE — L 2 Интервью по электричеству Лаборатория электриков Электротехника MCQ Викторина по электричеству Engg Заметки по механике Бесплатные книги G.K GATE GK International Days GK Awards GK Basic National GK Basic World GK Biology GK Chemistry GK Computer GK Electrics GK Famous

    Получить цену

    дизайн шлифовального станка школьного проекта

    Шлифовальные станки и металлорежущие станки используются для изготовления готовых изделий. продукты. Этот проект ориентирован на функции деталей, используемых в составе шлифовальных станков и металлорежущих станков. Проект был предложен как исследование дороговизны шлифовальных станков.

    Получить цену

    Ножницы

    Elite Metal Tools предлагает широкий выбор ножниц для различных применений. У нас есть ручные ножницы для листового металла, а также гидравлические ножницы для листового металла. Эти ножницы для листового металла острые как бритва и будут резать время от времени. Ознакомьтесь с нашим ассортиментом ручных ножниц для листового металла и гидравлических ножниц для листового металла и свяжитесь с нами, если у вас есть вопросы по выбору подходящего станка для

    Узнать цену

    Поддержка продукта

    Поддержка продукта

    — JURA USA.Здесь вы найдете ответы на свои вопросы о продукте JURA. Выберите линейку продуктов, а затем модель. Руководство по продукту в формате PDF, советы по использованию продукта и любые другие доступные ресурсы появятся на вкладках ниже. Выберите линию.

    Получить цену

    Установки экстракции растворителем: теоретическая диаграмма Тиле

    01 февраля 2017 г. Как будет видно позже, рабочие линии будут иметь разное происхождение (около 2,8 г / л в органической фазе и примерно 3,5 г / л в органической фазе для 13 об. / Л. и 17 об. / об. соответственно) из-за различных характеристик зачистки, но на рис.(xii) экстрагенту 13 об. / о. также потребуется соотношение O / A не менее 3: 1, чтобы функционировать при питании 12 г / л. в фазы редкоземельных элементов (РЗЭ) в остатках бокситов для улучшения технологий извлечения РЗЭ. Экспериментальные работы выполнялись методами электронно-зондового микроанализа с энергодисперсионной, а также спектроскопией с дисперсией по длинам волн и просвечивающей электронной микроскопией. РЗЭ находятся в виде дискретных минеральных частиц в остатках бокситов.

    Получить цену

    Флотация — The Anchor House, Inc.

    9 сентября, 2016 Процедура в некоторой степени аналогична стирке вашей грязной одежды в машине с тканью, являющейся эквивалентом не имеющей ценности каменной фазы, и грязными частями минералы РЗЭ, которые собираются на пузырьках. При флотации REE используются следующие основные этапы: 1.

    Get Price

    Home

    Функциональная тренировка, которая приучает вас к повседневной жизни. Freemotion CoachBike ™ — это самая интерактивная тренировочная программа на рынке, которая переносит велосипедистов в захватывающие места по всему миру.Инновационная и вдохновляющая машина, велосипед переосмысливает то, как мы думаем о тренировках в тренажерном зале.

    Получить цену

    Восстановление РЗЭ с конца

    20 сентября 2016 Постоянные магниты NdFeB имеют разные жизненные циклы в зависимости от области применения: от 2–3 лет в бытовой электронике до 20–30 лет в ветряных турбинах. Размер магнитов колеблется от менее 1 г в небольшой бытовой электронике до примерно 1 кг в электромобилях (EV) и гибридных и электрических транспортных средствах (HEV) и может достигать 1000–2000 кг в генераторах

    Get. Цена

    ИСП

    ИСП-МС обработки проб.В большинстве рутинных анализов ICP-MS образец вводится в виде жидкости с помощью распылителя и распылительной камеры. Распылитель использует сверхзвуковое расширение газа, чтобы превратить жидкость в мелкий туман, а затем распылительная камера удаляет все капли.

    Получить цену

    Покупки: Food Network

    Авторы: Мишель Баричевич и Рэйчел Трухильо. Отметьте преддверие праздников вином, сыром и, конечно же, шоколадом! 5 лучших тостеров, протестированных Food Network Kitchen. По: Food Network

    Получить цену

    SF Bay Area про услуги шлифования конуса шпинделя?

    12 июня 2018 Конус стандартный NMTB40 с дышлом 5 / 8-11.Шпиндель представляет собой съемный картридж, который можно отправить как единое целое, чтобы конус можно было шлифовать на собственных подшипниках. Я ищу хорошую шлифовальную машину, чтобы почистить эту штуку. Стоит ли рассматривать шлифовку на месте или это будет стоить Луны из-за дорожных расходов?

    Получить цену

    Мировой спрос на редкоземельные ресурсы и стратегии для

    01 октября 2016 г. Планируется, что к 2020 году глобальный спрос на РЗЭ будет расти на 5% в год.

  • Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.